DNA 非整倍体作为长期演化多形性腺瘤的一种拓扑恶性转化模式：一例病例报告
抽象的
我们介绍一例颌下多形性腺瘤的长期演变病例。关于多形性腺瘤的拓扑恶性转化模式的信息很少。
我们深入分析了一名 57 岁白人女性 25 年来罹患的巨大颌下混合瘤。使用流式细胞术分析评估了不同浅表和深层区域的脱氧核糖核酸倍体，并与病理和免疫组织化学特征相关联。浅表区域呈现典型的组织学多形性腺瘤模式，为脱氧核糖核酸二倍体。深层样本显示脱氧核糖核酸非整倍体、非典型组织学良性特征和与恶性转化早期有关的标志物的表达，例如肿瘤蛋白 53 和抗原 Ki67。
这些发现表明，深部肿瘤区可能参与恶性转化的初始阶段。脱氧核糖核酸倍性分析可以提供额外的诊断工具，并指出需要仔细研究以避免诊断错误的“不确定”区域。需要进行更大规模的研究来证实我们的结果并评估该技术的实用性。
介绍
多形性腺瘤 (PA) 是唾液腺中最常见的良性肿瘤，其恶性转化为癌性多形性腺瘤 (CXPA) 占唾液腺所有癌症的 4.5% 至 15% [1]。CXPA 的诊断基于上皮恶性肿瘤与组织学良性 PA 共存 [2]。这些肿瘤通常被视为高级别癌，经常发生转移和疾病相关死亡 [3]。
PA 的长期发展可能会增加恶性转化的风险 [4]。尽管罕见，但已有报道的巨型 PA 病例，其中大多数涉及腮腺 [5–7]。在这些病例中，误诊并不罕见，因为 CXPA 成分可能很小，因此在组织学分析中被遗漏。文献中发表的系列文章很少，重点关注倍性分析以预测肿瘤侵袭性和区分良性和恶性涎腺肿瘤 [8–10]。然而，尚未描述细胞计数参数与组织学或免疫组织化学参数之间缺乏相关性。
本病例报告旨在分析一例 25 年来演化的巨大 PA 肿瘤。使用流式细胞术分析评估不同区域的脱氧核糖核酸 (DNA) 倍体，并将其与病理和免疫组织化学特征相关联，以评估倍体分析是否可以提高预测恶性肿瘤的诊断准确性。
病例介绍
一名 57 岁的白人女性，因一个大的无痛性下颌下肿块就诊。该病变已存在约 25 年，大小缓慢增大。我们患者的病史无异常。体格检查发现她的右下颌下区域有一个约 8×6 厘米的巨大无痛、可移动、半硬弹性肿块。细针穿刺细胞学检查提示为 PA。增强计算机断层扫描证实她的右下颌下区域有一个边界清晰的巨大肿块，没有囊性改变（图 1）。未检测到淋巴结肿大或其他肿瘤病变。在全身麻醉下实施了下颌下肿瘤摘除术。
图 1
术前计算机断层扫描显示右颌下区域有一个大的、边界清晰的肿块，没有囊性改变或坏死区域。
切除后立即在手术室内按照解剖图采集样本（图2），第1组取自肿瘤周边，邻近皮下组织处6个样本；第2组取自肿瘤周边，邻近口底处6个样本；第3组沿中线切开肿瘤，从肿瘤中心处采集6个深层样本。
图 2
切除的多形性腺瘤的宏观概览和所获样本的地形图。第 1 组：毗邻皮下组织的浅表样本；第 2 组：毗邻口底的浅表样本；第 3 组：深层样本。
每组样本的一半用 4% 缓冲福尔马林固定，按照常规程序处理并嵌入石蜡中，进行组织学和免疫组织化学分析。每组剩余的新鲜材料样本立即送去进行 DNA 流式细胞术分析。其余手术标本在病理科进行常规研究，并诊断为良性 PA。
用手术刀将各组样本在磷酸盐缓冲盐水溶液中切碎。通过 50 μm 尼龙网过滤制备单核悬浮液。在 Cytomics FC500（美国加利福尼亚州富勒顿市贝克曼库尔特公司）流式细胞仪中测量 DNA 含量。绘制至少 10,000 个细胞核的 DNA 直方图。以来自同一位置的周围正常组织对应的 DNA-二倍体细胞群作为鉴定 DNA-非整倍体克隆的内参标准。使用 Modfit 5.2 软件包计算非整倍体克隆的细胞周期阶段百分比以及 DNA 指数。如果 DNA 直方图只有一个 G0-G1 峰，则归类为二倍体，如果存在额外的 G0-G1 峰，则归类为非整倍体。非整倍体G0-G1峰值与二倍体G0-G1峰值的比值以DNA指数表示。所有标本的G0-G1峰变异系数不超过4％。以下是细胞计数变量：DNA倍性，DNA指数和S期分数。DNA指数在0.9至1.10之间的病例被认为是DNA二倍体，小于0.9或大于1.10的病例被认为是DNA非整倍体。
三组中一半的石蜡包埋样本常规用苏木精和伊红染色。其余石蜡样本用标记聚合物法进行免疫组织化学染色，所用抗体为抗α-平滑肌肌动蛋白 (α-SMA)、细胞角蛋白 (CK) AE1/AE3、CK 8、蛋白 53 (p53)、蛋白 63 (p63) 和抗原 Ki67。
第 1 组样品的直方图在 G0-G1 区域呈现单峰。细胞核在 G2 区域的比例为 5.91%，在 G1 区域的比例为 91.30%。S 期细胞比例为 2.78%，变异系数 (CV) 为 3.70%。该组样品被认为是 DNA 二倍体 (图 3A)。第 2 组样品也表现出 DNA 二倍体模式，G1 区域的比例为 88.26%，在 G2 区域的比例为 8.80%。S 期比例为 2.95%，CV 为 3.04% (图 3B)。第 3 组样本显示 DNA 非整倍体：48.70% 的细胞群被认为是二倍体，其中 4.18% 位于 G2 区，91.27% 位于 G1 区，CV 为 2.17%，而 51.30% 的分析细胞呈现非整倍体模式，其中 10.53% 位于 G2 区，89.03% 位于 G1 区，CV 为 7.08%。总非整倍体 S 期为 0.44%，总 S 期分数为 2.45%（图 3C）。
图 3
新鲜材料流式细胞术的直方图。（A）第 1 组样本的直方图显示 G0-G1 区域（DNA 二倍体）的单个峰。（B）第 2 组样本的直方图也呈现二倍体模式。（C）第 3 组（深）样本的直方图显示 DNA 非整倍性。
第 1 组和第 2 组样本的组织学分析显示，粘液样基质中存在无异形性的导管结构、索状和多边形细胞岛、片状和条状透明细胞或浆细胞样细胞。这些发现与 PA 一致（图 4A）。在免疫组织化学中，CK AE1/AE3 和 CK 8 在导管细胞中呈弱阳性（图 4C-F）。非管腔细胞强烈表达 α-SMA（图 4B）。偶尔有细胞对增殖抗原 Ki67 呈阳性，而 p53 未见表达（图 4D-G）。否则，肌上皮细胞对 p63 表现出高度阳性的核染色（图 4E）。
图 4
对浅表区域 (第 1 组和第 2 组) 进行组织学和免疫组织化学评估。(A) 苏木精和伊红染色显示粘液样基质中没有异形性的多边形细胞索和岛 (放大 200 倍)。(B) 基底细胞和肌上皮细胞高度表现出 α-SMA (放大 200 倍)。(C) 观察到 CK 8 略有阳性 (放大 200 倍)。(D) p53 无表达 (放大 200 倍)。(E) 基底细胞和肌上皮细胞高度表现出 p63 (放大 200 倍)。(F) 观察到 CKs AE1/AE3 略有阳性 (放大 200 倍)。(G) 仅偶尔有细胞对抗原 Ki67 呈阳性 (放大 100 倍)。
第 3 组样本表现出不寻常的组织学模式。这些细胞过多的区域由圆形至卵圆形的上皮细胞块组成，没有“复现性”肌上皮。上皮细胞呈圆形，胞浆呈淡嗜酸性，细胞核呈圆形至卵圆形。未观察到核多形性或异形性、恶性管腔细胞和坏死灶（图 5A）。免疫组织化学研究显示，大多数上皮细胞中 CKs AE1/AE3 和 CK 8 表达强烈（图 5C-F）。p63 和 α-SMA 染色程度低于第 1 组和第 2 组样本（图 5B-E），而抗原 Ki67 的表达更强烈（图 5G）。p53 在少数上皮细胞中表达（图 5D）。
图 5
深层区域（第 3 组）的组织学和免疫组织化学评估。（A）苏木精和伊红染色显示由圆形至卵圆形上皮细胞组成的细胞过多区域，没有细胞核多形性或异形性（放大 200 倍）。（B）仅在少数肌上皮细胞中检测到 α-SMA 免疫染色（放大 100 倍）。（C）CK 8 在大多数肿瘤细胞中强烈表达（放大 200 倍）。（D）在少数上皮细胞中检测到 p53 阳性（放大 200 倍）。（E）仅在少数肌上皮细胞中检测到 p63 免疫染色（放大 100 倍）。（F）CK AE1/AE3 在大多数肿瘤细胞中强烈表达（放大 100 倍）。（G）Ki67 抗原表达更强比第 1 组和第 2 组更明显（放大 100 倍）。
讨论
PA 是最常见的良性涎腺肿瘤 [1,2]。它源自上皮，通常表现为细胞学上良性的边界清晰的肿块，具有可变的包膜。这种肿瘤是少数可能发生恶性转化的良性肿瘤之一。文献记录的恶性转化倾向为 1.9% 至 23.3%，CXPA 约占恶性肿瘤的 12% [2,11,12]。此外，据估计，未经治疗的混合肿瘤中约有 25% 最终会发展为癌 [13]。PA 发生恶性变化的可能性会随着肿瘤持续时间的增加和患者年龄的增长而增加。CXPA 的诊断需要存在可识别的与癌相关的混合肿瘤或癌在先前的混合肿瘤部位发展为复发性肿瘤。恶性肿瘤的标准包括侵袭性、细胞间变性或多形性、非典型有丝分裂和异常结构模式[1,3]。
目前推测恶性转化伴有基因组不稳定性（细胞遗传学和/或细胞计数非整倍体）[14]。D

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