成人急性髓系白血病新生病例报告，FLT3 基因近跨膜区有两个新突变
抽象的
约 30% 的成人急性髓系白血病 (AML) 患者在其近膜结构域 (JMD) 中出现 fms 样酪氨酸激酶 3 基因 (FLT3) 内部串联重复 (FLT3/ITD)。FLT3/ITD 的大小从三个核苷酸到数百个核苷酸不等，预后不良。关于 FLT3/ITD 长度与这些 AML 患者的临床结果之间可能存在的关系的研究尚无定论。
我们在此报告一名 54 岁的阿拉伯男性，被诊断患有 AML，除了 NPM1 突变外，还患有两个 FLT3-ITD 突变。采用细胞遗传学方法（显带细胞遗传学）和荧光原位杂交 (FISH)，使用特异性探针检测易位 t(8;21)、t(15;17)、t(16;16)、t(12;21) 和缺失 del(13q))，以排除染色体异常。分子遗传学方法（聚合酶链反应 (PCR) 和 Sanger 测序）确定了 FLT3-ITD 中两个新突变的组合，但尚未报告。第一个突变在 JMD 中诱导了移码，第二个突变也导致 JMD 中 c.1836T>A (p.F612L) 的纯合置换。此外，还检测到了 NPM1 A 型突变。第一次化疗治疗成功，但在初次诊断1个月后，患者病情复发，不幸去世。
据我们所知，JMD 中的两个 FLT3-ITD 突变与 NPM1 A 型突变的组合在成人 AML 中尚未报道过。需要进一步研究来证明或排除这些 FLT3-ITD 突变的大小以及 FLT3-ITD 中潜在的其他双重突变是否与观察到的不良结果相关。
背景
急性髓系白血病（AML）患者的基因诊断过去主要通过细胞遗传学和分子细胞遗传学进行。近年来还增加了肿瘤标志物，这依赖于分子遗传学方法[1]。
fms 样酪氨酸激酶 3 (FLT3) 基因编码 FLT3 配体的 III 类酪氨酸激酶受体，该受体通常在 CD34+ 造血干细胞/祖细胞中表达，在正常和白血病造血中都发挥着重要作用 [2]。FLT3 基因的内部串联重复 (ITD) (FLT3/ITD) 是 AML 患者最常见的分子异常之一。在所有患者中，约有 25-30% 的患者可检测到它们 [3,4]。ITD 由位于 FLT3 分子近膜结构域 (JMD) 的重复序列的框内插入组成。它们的存在导致 FLT3 受体酪氨酸激酶活性的组成性、配体非依赖性激活；这导致白血病干细胞异常增殖和分化 [2]。在 AML 中，激酶结构域的组成性激活是由于 JMD 和活化环之间的自抑制相互作用被破坏所致，而活化环通常会稳定无活性的激酶，同时保护 ATP 结合口袋 [5,6]。FLT3/ITD 还能保护白血病细胞免受有害化疗药物的伤害 [7]。
有人提出，增加 ITD 等附加序列的长度可能会影响 FLT3 受体酪氨酸激酶活性的等级，并可能 (1) 导致活化水平逐渐升高和 (2) 使受影响患者的总体生存率 (OS) 恶化。然而，研究 ITD 长度对临床结果影响的研究结果却相互矛盾。一些研究证实了上述假设 [8,9,10,11,12]，而其他研究则与之相反 [13,14]。
FLT3/ITDs 的存在与初始外周白细胞 (WBC) 计数和骨髓原始细胞百分比增加、无病生存期 (DFS) 和 OS 减少以及高复发率和总体预后不良有关。然而，完全缓解 (CR) 率并未受到显著影响 [15,16,17]。因此，FLT3/ITDs 已被提示具有预后意义 [8]。根据美国国家综合癌症网络和欧洲白血病网络 (ELN) 2017 年的数据，具有细胞遗传学正常核型和 FLT3/ITD 突变的 AML 病例预后不良。
除 FLT3/ITD 突变外，核仁磷蛋白 1 (NPM1) 基因突变是 AML 患者中第二常见的分子畸变 [18]。突变的 NPM1 和野生型 FLT3 基因 (NPM1+/FLT3−) 的组合状态是年轻患者的一个公认的有利风险因素，复发概率较低，生存期延长 [19,20,21]；这些患者无需接受异基因造血干细胞移植 [22]。此外，与仅具有 FLT3/ITD 突变的 AML 患者相比，FLT3/ITD 和 NPM1 突变同时发生可部分改善缓解率、DFS 和 OS 结果。然而，FLT3/ITD 和 NPM1 突变病例的预后比具有 (NPM1+/FLT3−) 突变的病例更差 [23]。
这里我们介绍了一个独特的病例，其中 JMD 中存在两个 FLT3-ITDs 突变，并且存在与不良结果相关的 NPM1A 型基因突变。
病例介绍
2019 年 10 月，一名 54 岁的阿拉伯男性患者出现 2 个月的疲劳、直立性低血压，随后出现右下肢瘀伤、黑便（仅持续一个月）和呼吸困难 II。体格检查和计算机断层扫描显示肝肿大（4 厘米）。他没有恶性肿瘤家族史，也没有接触毒素或动物的社会和环境史。外周血 (PB) 的初步实验室评​​估显示白细胞计数 (WBC) 为 26.3 × 109/l（10% 为原始细胞）。骨髓 (BM) 抽吸物的病理学检查特征为细胞增多，60% 为原始细胞。流式细胞术 (FCM) 分析根据世界卫生组织 (WHO) 分类将此病例归类为 AML-M2。异常细胞群 (60%) 对 CD45dim、CD34、HLADr、CD13、CD33 呈阳性，且异质性表达 CD117。原始细胞群对 CD3、CD117、CD14、cCD3、cCD79a、CD14、CD11c、CD38、CD64、CD32、CD7、CD19、CD10 和 CD5 呈阴性。
患者接受 AML 标准治疗，包括 3 + 7 诱导化疗（柔红霉素 60 mg/m2，3 天，阿糖胞苷 200 mg/m2，7 天）。一个月后，在 3 + 7 方案治疗下，患者复发，即他的 PB 显示 WBC 为 107 × 109/l、贫血（血红蛋白水平 (Hgb) = 8.8 g/dl）和血小板减少（Plt 93 × 109/l）。患者接受 3 + 7 化疗方案再次诱导（更多详细信息见表 1）。复发后不到一个月，患者出现了中性粒细胞减少、中性粒细胞减少性小肠结肠炎和尿崩症等其他严重症状，不幸的是，患者因呼吸和心脏骤停而去世。未进行尸检。患者的兄弟同意对该病例的科学评价，该研究已获得叙利亚高等教育部大马士革大学药学院伦理委员会审查委员会批准，编号为 2/2019。
根据标准方案，在化疗前采集的 BM 样本上进行 GTG 显带染色体分析 [24]。诊断为正常男性核型。使用特异性探针检测易位 t(8;21)、t(15;17)、t(16;16)、t(12;21) 和缺失 del(13q) 的荧光原位杂交 (FISH) 也用于排除染色体异常，如先前报道的那样 [24]。
为了进行分子分析，在化疗前从 PB 细胞（EDTA 血液）中提取了整个基因组 DNA。使用基因组 DNA 的聚合酶链式反应 (PCR) 扩增和 Sanger 测序来筛选以下基因的突变存在：FLT3/ITD（外显子 11 和 12）、FLT3-KTD 和 NPM1；使用之前报告的每个突变的特异性引物 [25]。通过 Sanger 序列分析确认了 ITD；使用 ABI Prism 310 基因分析仪（Applied Biosystems，美国加利福尼亚州福斯特城）在我们的患者中鉴定了 330 bp 长度的野生型条带和其他不同大小的 PCR 产物（图 1）。在我们的患者中发现了 FLT3-ITD 中 JMD 的两个新移码突变（另见图 2）：
图 1
琼脂糖凝胶电泳。ITD的PCR扩增产物。M表示分子量标记（100 bp）；第1行，空白PCR产物；第2和5行，野生型FLT3-ITD；第3行，本例中的390 bp条带；第4行，突变型FLT3-ITD。
图 2
ITD 突变的 Sanger 序列分别揭示了插入和重复的突变序列。
突变 1：c.1779-1780insTTTCAGAGAATATGAATATGATCTCAAATGGGAGTTTCCAAGAGAAAATTTAGAGTTAGG（p.D593-F594insREYEYDLKWEFPRENLEF）。
突变2：纯合替代c.1836T>A（p.F612L）。
FLT3-KTD 检测未检测到本例患者的 D835 突变。然而，患者也存在 NPM1 A 型突变（数据未显示）。
讨论和结论
我们在此报告了第一例成年 AML 患者，该患者具有正常核型，有一个 NPM1A 型突变和两个移码 FLT3-ITD 突变。第一个移码 FLT3-ITD 突变以前从未被报道过（COSMIC 数据库中的造血和淋巴组织体细胞样本），而第二个突变已经观察到，但为杂合变体（COSV54057677）。
本案例支持先前的研究结果 [8,9,10,11,12]，即长 ITD 与不良 OS、较高的复发发生率以及对 AML 患者化疗后临床结果的负面影响相关。
特别值得注意的是，正如我们患者所观察到的（见表 1），强烈化疗的并发症也可能是由观察到的突变事件组合所促成的。观察到的中性粒细胞减少症与发生严重和复杂感染甚至败血症的风险有关 [26,27,28]。此外，中性粒细胞减少性小肠结肠炎 (NE) 是一种通常局限于升结肠、盲肠和回肠末端的坏死性过程 [29,30]，在接受伊达比星和阿糖胞苷联合治疗的 AML 患者中，15% 的患者会出现该症状 [31]，这也与死亡率增加有关 [32]。最后，中枢性尿崩症 (DI) 是 AML 和骨髓增生异常综合征 (MDS) 病例中罕见的并发症，文献中报道的病例不到 100 例 [33]。中枢性尿崩症可能在 AML 或 MDS 诊断之前出现，也可能在治疗期间表现出来，并被认为预后不良 [33]。 AML 和 MDS 中枢性 DI 的发病机制可能继发于漏斗部白血病浸润、出血、血栓形成、感染或自身免疫 [34]。
需要进一步研究来证明或排除 FLT3-ITDs 突变的大小和 FLT3-ITD 的双重突变是否与不良预后相关。此外，还需要进行更多研究来确定是否可以通过应用其他治疗方案来避免此处观察到的化疗并发症。
数据和材料的可用性
本出版物包含所有相关数据和材料。
缩写
急性髓系白血病
骨髓
完全缓解
无病生存期
尿崩症
荧光原位杂交
流式细胞术
Fms样酪氨酸激酶3基因
近膜结构域
内部串联重复
骨髓增生异常综合症
核磷蛋白1基因
中性粒细胞减少性小肠结肠炎
总体生存率
外周血
白细胞
世界卫生组织
参考
Kirtonia A, Pandya G, Sethi G, Pandey AK, Das BC, Garg M. 全面回顾急性髓系白血病个性化医疗实施中的基因改变和分子靶向治疗。J Mol Med (Berl)。2020；98：1069–91。
文章Google学术
Stirewalt DL, Radich JP。《FLT3 在造血系统恶性肿瘤中的作

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