SMPD1基因深度测序揭示一名巴勒斯坦婴儿患有A型尼曼匹克病，存在杂合移码突变（p.Ser192Alafs）：病例报告
抽象的
尼曼-匹克病是由溶酶体酶酸性鞘磷脂酶水平降低引起的。根据疾病类型，儿童的存活期为 2 至 12 岁。已知主要有两种类型：A 型和 B 型。A 型尼曼-匹克病的特征是严重的中枢神经系统恶化和肝脾肿大，而 B 型则是进行性脾功能亢进，伴有肺功能逐渐恶化。
我们描述了一名 11 个月大的巴勒斯坦男婴，该男婴患有肝脾肿大、肌张力低下、运动发育迟缓、喉软化、双侧樱桃红斑点和发育不良。进行了代谢筛查、血细胞计数、鉴别测试、免疫学筛查、传染病筛查、尿液、生化测试以及分子诊断。分子诊断是通过扩增整个鞘磷脂磷酸二酯酶 1 (SMPD1) 基因，然后进行深度测序来完成的。对获得的序列进行比对、从头组装并与人类参考基因 (GenBank GeneID: NG_011780.1，Ensembl 版本 ENSG00000166311 和蛋白质标识为 UniProtKB – P17405) 进行比较。
在我们的患者中发现了两种已知突变：致病性移码突变 NM_000543.4(SMPD1):c.573delT (p.Ser192Alafs) 和良性多态性 NM_000543.4(SMPD1):c.107T>C (p.Val36Ala)。酶研究表明酸性鞘磷脂酶的酶活性水平非常低（每小时 0.1 nmol/ml）。本文介绍了临床发现、实验室数据和序列分析之间的相关性。
总之，这是第一份关于巴勒斯坦 A 型尼曼匹克病患者杂合子移码 p.Ser192AlafsX65 的报告，强调了深度测序在这种罕见遗传疾病的基因诊断中的重要性。
背景
尼曼-匹克病 (NPD) 是一种常染色体隐性遗传疾病，由鞘磷脂磷酸二酯酶 1 (SMPD1) 基因编码的酸性鞘磷脂酶 (ASM) 表达降低引起，导致鞘磷脂在脑内溶酶体积聚 [1,2]，造成不可逆的神经损伤。据估计，每 250,000 人中就有 1 人患有 A 型和 B 型 NPD。A 型是一种早发性神经退行性疾病，以严重的中枢神经系统衰竭、樱桃红斑和大量肝脾肿大为特征，导致患者在幼年时死亡 [3]。B 型是一种晚发性非神经病变疾病，具有中期临床表现，与肝脾肿大和呼吸道并发症有关。大多数此类病例可存活至成年 [1,2]。
使用诸如新一代测序 (NGS) 之类的先进技术在包括杂合子识别在内的灵敏而准确的诊断程序中起着至关重要的作用，而与 NGS 相比，使用 Sanger 测序或酶促分析搜索特定点突变的灵敏度有限。因此，建议使用 NGS 同时检测多个外显子/内含子中的突变。Conley 和 Casanova [4] 描述了使用 NGS 识别具有可变渗透性的常染色体显性免疫缺陷中的 34 多种新基因缺陷，并揭示了具有严重表型的疾病中的新生突变。这种方法是识别不同患者致病基因突变的有力工具。
分子生物学的最新进展已确定在 A/B 型 NPD 患者中发现了 100 多种 SMPD1 突变，这些突变已列在人类基因突变数据库 (HGMD) 中。这些突变大多数是错义突变 (65.4%) 或移码突变 (19%)。缺失突变 NM_000543.4(SMPD1):c.1829_1831delGCC (p.Arg610del) 被认为是全球最常见的报告突变，与 B 型 NPD 表型减弱有关 [5]。40 种突变在体外表达，氨基酸替换对 ASM 活性的影响已得到广泛研究。12 种突变保留了高于野生型 5% 的残留酶活性。其中 11 种是在 B 型 NPD 患者中发现的。p.Phe572Leu 保留了野生型 30% 的残留活性。这种突变是在一名具有复合杂合性的 A 型 NPD 患者身上发现的，同时还伴有 p.Gly247Ser 突变 [6,7]。据报道，有六种突变与 A 型疾病有关 [8,9,10,11]。其中，三种突变是在这种疾病相对常见的阿什肯纳兹犹太患者中发现的 [8,9,10,11]。Gluck 及其同事 [12] 研究了 12 个患有 A 型 NPD 疾病的阿拉伯以色列家庭，他们居住在巴勒斯坦下加利利和西岸。对这些患者的分子分析发现了 SMPD1 基因 677delT 中一个新的单碱基对 (bp) 缺失 [12]。1977 年 [13]，一名未经基因分析的阿拉伯女婴被报道患有 A 型 NPD。在这里，我们描述了一项高通量测序研究，该研究对一名巴勒斯坦男性患者的 A 型 NPD 进行了研究，并与临床和生化数据进行了关联。
病例介绍
一名 11 个月大的巴勒斯坦男婴出现腹部膨胀、肝肿大和脾肿大。经评估，他的体重为 8.2 公斤（第三百分位）、身高 76 厘米（第 75 百分位），头围为 45.8 厘米（第 75 百分位）。他的父母是堂兄弟姐妹；我们的患者有三个姐妹。他们都是健康的阿拉伯穆斯林后裔，来自巴勒斯坦卡尔基利亚区西尔村。
进行了全面代谢筛查、血细胞计数、鉴别检查、免疫学筛查、传染病筛查、尿液和生化检查以及氨基酸筛查，如表1所示。
使用 NucleoSpin® 血液 DNA 提取方法（德国 MACHEREY-NAGEL）从我们的患者和他母亲的血液中提取基因组 DNA。由于无法获取，他父亲的血液样本无法进行分析。使用 LongAmp™ Hot StartTaq2X Master Mix（New England BioLabs）和两个引物 SMPD1-P1F：AGAAGGTAATCGGGTGTCC 和 SMPD1-P4R：AGCTCCAGGAAAGGAGAAGG（参见 Zhanget al. [14]）扩增整个 SMPD1 基因，包括外显子和内含子（4276 bp）。这些引物是从之前用于扩增相对较短序列的四组引物中选出的，然后使用 Geneious 生物信息学软件进行从头组装以获得全长的 SMPD1 基因 [14]。聚合酶链式反应（PCR）如下进行：35 个循环，98°C 10 秒，53°C 15 秒，72°C 50 秒，然后循环 72°C 5 分钟。PCR 产物在 TapeStation 机器（Agilent）上可视化，用 AMPure XP 珠子 - Beckman Coulter（X0.6）清洗，并在 25 μl 洗脱缓冲液中洗脱。将产物再次加载到 TapeStation（Agilent）上以确认扩增产物的确切大小和清洗效率。用 Qubit® 荧光计（Invitrogen）机器定量 PCR 产物并稀释至 0.2 ng/μl。最后，按照制造商的建议，使用 Nextera XT 试剂盒（Illumina）使用 1 ng 来制备下一代文库。用 TapeStation 和 Qubit 机器再次评估文库纯度和数量。从两个样本中制备出浓度为 4 nM 的溶液。每个样本的目标读数为 200 万次。使用 150 循环中输出试剂盒 (Illumina) 在 NextSeq 500/550 机器上对样本进行深度测序。
使用 Geneious 生物信息学软件（Biomatters Ltd.，奥克兰，1010，新西兰）对 DNA 序列进行从头组装并与人类参考基因（GenBank；GeneID NG_011780.1，Ensembl 版本 ENSG00000166311 和蛋白质鉴定为 UniProtKB – P17405）进行比对。多重序列比对在线进行（http://multalin.toulouse.inra.fr/multalin/），如 Corpet [15] 所述。
由于发烧和咳嗽，我们给患者做了胸部X光检查，结果正常。超声检查显示他的肝脏为 12.1 厘米（正常上限为 10 厘米），脾脏为 8.3 厘米（正常上限为 8.0 厘米）。未观察到淋巴结肿大。轻度肝脾肿大而无淋巴结肿大的鉴别诊断可能是代谢或血液系统疾病。眼科检查发现双眼黄斑处有一个樱桃红色斑点。
全血细胞计数、鉴别试验和凝血试验均正常。微生物血培养为阴性。此外，爱泼斯坦-巴尔病毒 (EBV)、巨细胞病毒 (CMV)、肝炎 (A-C)、风疹、弓形虫、内脏利什曼病、儿童呼吸道检查和抗组织谷氨酰胺的所有检测均为阴性。
尿液分析正常。分子微生物学检测显示定量 PCR 检测 EBV 和 CMV 呈阴性。
患者有明显的高脂血症，即总胆固醇、低密度脂蛋白（LDL）和甘油三酯升高，而高密度脂蛋白（HDL；0.16 mmol/L）低于正常值（表1）。胆固醇/HDL 比值（30.25）明显高于正常值（≤4.5）。
氨基酸筛查显示蛋氨酸（63 Umol/L）和苏氨酸（216 Umol/L）水平较高。血清碱性磷酸酶（ALK）、丙氨酸氨基转移酶（ALT）、天冬氨酸氨基转移酶（AST）和C反应蛋白（CRP）均高于正常值（表1）。
检测了几种代谢酶，结果正常（表1）。α-半乳糖苷酶稍低，但不在疾病范围内。
尿液中的生理性寡糖不会引起寡糖病（表1）。进行了唾液酸测定，未观察到游离N-乙酰神经氨酰酸（NANA）储存或排泄增加，因此排除了Salla病。检查了血浆游离和总肉碱，发现游离和总肉碱略有下降。鞘磷脂酶活性显着降低0.1 nmol/ml每小时（参考值> 2.5 nmol/ml每小时）。根据临床发现和实验室检查，我们的患者被诊断为NPD。因此，需要对SMPD1基因序列进行遗传分析，以确定该疾病分子基础的致病突变。
正如预期的那样，使用两个引物 SMPD1-P1F 和 SMPD1-P4R (图 1)，两个 DNA 样本（来自我们的患者和他的母亲）的扩增产物显示出大约 4276 bp 的条带。对获得的 DNA 序列进行比对、从头组装，并与已发表的基因序列（GenBank GeneID：NG_011780.1，Ensembl 版本 ENSG00000166311 和蛋白质鉴定为 UniProtKB – P17405）进行比较。从母亲和患者样本分别获得了 4225 和 4229 bp 的 DNA 序列。整个基因显示深度 >3000X。
图 1
使用 TapeStation 机器评估 DNA 大小。包括 DNA 分子标记；标明上带（紫色，10 千碱基对）和下带（绿色，25 碱基对）。bp碱基对
对我们患者及其母亲的样本进行 SMPD1 序列分析，发现了相同的两个杂合突变：在编码序列的第 2 外显子的第 573 位缺失一个碱基胸苷（图 2a），在第 1 外显子的第 107 位发生替代突变 (T>C)。核苷酸根据参考序列进行编号（GenBank GeneID：NG_011780.1，Ensembl 版本 ENSG00000166311 和蛋白质鉴定为 UniProtKB – P17405）。 NGS 鉴定出 4 个序列变异：在变异 1 中检测到单核苷酸多态性 (SNP) 579C/T。变异 2 被证实为正常，在变异 3 中检测到移码 c.573delT (NM_000543.4(SMPD1):c.573delT (p.Ser192Alafs)（图 2a 和 b）。第四个变异为 c.107，导致位置 36 的缬氨酸转化为丙氨酸 (NM_000543.4(SMPD1):c.107T>C (p.Val36Ala))。值得注意的是，我们的患者和他的母亲共享这两个变异，如图 3a 和 b 所示。为了排除其他可能的因果 SMPD1 变异的存在，使用两组正向和反向特异性引物，然后进行测序。
图 2
aDNA 序列比对。HomoRefSeq：人类参考基因序列；rs727504167，GenBank 单核苷酸多态性参考数据库中的 rs72750416

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