磁共振成像追踪自体骨髓间充质干细胞移植治疗慢性脊髓损伤：一例病例报告
抽象的
鞘内移植是一种微创的干细胞输送方法，但尚未在人类身上证实这些细胞是否会从腰椎迁移到受伤的颈椎。我们描述了一种在患有慢性颈椎损伤的患者体内追踪骨髓间充质干细胞的尝试。
一名 33 岁的泰国男子因寰枢椎半脱位导致脊髓损伤不完全，他被纳入了一项试点研究，该研究旨在追踪脊髓慢性损伤鞘内移植中用超顺磁性氧化铁纳米粒子标记的骨髓间充质干细胞。自 2005 年以来，他一直依赖呼吸支持。在过去的 54 个月里，他的神经功能没有任何改善。从他的髂嵴中提取了骨髓间充质干细胞，并重新植入到目标数量。在移植到 L4 和 L5 之间的鞘内之前，一半的细胞都用超顺磁性氧化铁纳米粒子标记。移植后立即进行核磁共振成像研究，并在移植后 48 小时、两周、一个月和七个月进行。移植后立即进行的磁共振成像扫描显示，腰椎区蛛网膜下腔顺磁性物质标记的干细胞信号强度较低。48小时后，在他的颈髓周围的表面也观察到了这种现象。48小时后，磁共振成像检测到颈髓局部标记骨髓干细胞信号强度较低，两周后消退，一个月后消失。在本研究结束时，神经功能无临床改善。然而，在移植后48小时，他出现发烧、头痛、肌痛和运动功能恶化（根据美国脊髓损伤协会损伤量表，所有主要肌肉均下降一级），持续48小时。
在腰椎脊柱水平上，骨髓来源的干细胞可以在移植后的前48小时内仔细观察到骨髓脊柱水平的骨骼脊髓。
介绍
脊髓损伤通常会导致长期残疾，因为改善神经系统状况的治疗方法有限。寻找一种新的特定治疗方法来治疗这种损伤是一项重大的临床挑战，然而，干细胞移植是修复受损脊髓的一种可能方法 [1,2]。自体骨髓间充质干细胞 (BMSC) 是脊髓损伤研究中报道较多的干细胞之一 [3,4]。
鞘内移植是一种颇具吸引力的 BMSC 移植方法，因为它需要简单的技术和微创的方法。鞘内 BMSC 移植可以有效地将细胞输送到受伤的脊髓 [5-9]。在大鼠模型中，鞘内移植可以通过血脑屏障将 BMSC 输送到脊髓；此外，注入脑脊液的 BMSC 可促进受伤脊髓的功能恢复，减少空洞形成 [8,10,11]。尽管如此，鞘内移植并不是直接移植到脊髓的受伤部位；在人类中，尤其是在慢性脊髓损伤的情况下，腰椎水平的鞘内移植细胞是否会迁移到颈部等受伤程度更高的区域还存在疑问。细胞追踪技术将有助于获取有关鞘内移植中细胞迁移的更多信息。
使用超顺磁性氧化铁纳米粒子 (SPION) 标记细胞是脊髓损伤情况下追踪干细胞的一个有趣选择 [12,13]。这是一种细胞内标记，可为追踪活细胞提供高特异性。用 SPION 标记细胞的制备方法简单，低剂量不会影响细胞的增殖和分化 [14-16]。此外，用 SPION 标记的细胞可使用磁共振成像 (MRI) 检测，这对临床评估很有用。
我们描述了一名患有慢性颈脊髓损伤的患者的情况，该患者参加了一项研究，该研究试图在鞘内移植后追踪用 SPIONS 标记的 BMSC。此外，还评估了使用鞘内 SPION 标记的 BMSC 移植的临床结果和安全性。
病例介绍
我们针对两年多前发生过颈椎完全或不完全脊髓损伤的患者开展了一项试点研究。我们的患者来自泰国曼谷 Siriraj 医院的脊柱科。本研究的方案经过当地伦理委员会（玛希隆大学 Siriraj 医院医学院人体研究伦理委员会（批准号：Si084/2009））的审查和批准。本研究已在泰国临床试验注册中心（www.clinicaltrials.in.th）注册；注册号为 20140611001。我们的患者是参加这项试点研究的唯一患者。
我们的患者是一名 33 岁的泰国男性，因寰枢椎半脱位导致脊髓损伤不完全，四肢瘫痪。MRI 显示他的脊髓受到寰椎后弓的压迫。2005 年 5 月，他接受了牵引复位，并接受了寰枢椎融合术（使用钢丝固定），术后颈椎固定使用 Halo 背心固定。手术后，神经功能缺损部分改善。四年零六个月后，他的神经系统状况仍为四肢瘫痪，仍然依赖气管切开术进行呼吸支持。尽管接受了强化康复治疗，他的呼吸功能和运动功能没有进一步改善。他的感觉功能基本保留，但神经性疼痛遍布全身，尤其是左侧。通过计算机断层扫描 (CT) 扫描评估他的颈椎骨融合情况，他的寰枢关节已经融合。 2009年，他接受了3.0 Tesla MRI检查，结果显示其脊髓损伤。C1-C2颈髓直径较小，提示C1至C2-C3颈髓椎间盘发生萎缩性脊髓软化改变（图1）。
图 1
干细胞移植前颈脊髓磁共振成像扫描。矢状面和轴向 T2 加权 (A、C) 和轴向 T1 加权 (B) 扫描显示 C1-C2 水平颈脊髓直径较小，证实脊髓萎缩性改变 (箭头)。
我们与患者及其家人彻底讨论了这项研究，以避免任何道德问题。他和他的家人做出了决定，并签署了知情同意书，同意参加这项研究。
从他的髂嵴采集了总共 200 毫升的骨髓穿刺物。用 Ficoll-Hypaque 密度梯度离心法（IsoPrep®，Robbins Scientific，美国加利福尼亚州桑尼维尔）分离单核细胞。用含有 10% 胎牛血清（Biochrom，德国柏林）的杜氏改良 Eagle 培养基 (DMEM)（Gibco®，Life TechnologiesTM，美国纽约）培养单核细胞。在 5% 二氧化碳的湿润空气中将培养物保持在 37°C 下。每四天更换一次培养基。将细胞在原代培养中维持四周以增加细胞数量。培养干细胞的目标数量为 30×106 个细胞。培养 BMSC 样本以检测细菌和真菌；结果为阴性。分离出一半的 BMSC（15×106 个细胞）以 SPION 进行标记。将超顺磁性氧化铁剂（Resovist®，Schering，柏林，德国）以 100μg/mL 的浓度加入培养基中，将转染剂（硫酸鱼精蛋白（Leo Pharmaceutical，巴勒鲁普，丹麦））也以 4μg/mL 的浓度加入培养基中，然后混合约 10 分钟。混合后，将 12.5mL 标记培养基加入 150cm2 细胞培养瓶中 80% 汇合的 BMSC 单层中。孵育两小时后，将等体积的完全 DMEM 添加到培养物中，使 SPION 的最终浓度为 50μg/mL。细胞培养物孵育过夜。用含有肝素（Leo Pharmaceutical，Ballerup，丹麦）的磷酸盐缓冲液（PBS）冲洗样本，肝素浓度为10美国药典（USP）单位/mL。将用SPION标记的BMSC和未标记的BMSC混合并重新悬浮在生理盐水中。在腰椎处进行鞘内BMSC移植。然后立即进行MRI扫描以确认BMSC已注射到蛛网膜腔中。鞘内BMSC移植后，他保持Trendelenburg体位24小时。
我们使用 3.0 Tesla Philips Achieva MRI 扫描仪（荷兰贝斯特市 Philips Medical Systems 公司）进行 MRI 扫描，该扫描仪结合了两个不同的相控阵线圈：灵敏度编码 (SENSE) 脊柱线圈和 SENSE- 神经血管线圈，即双线圈成像的组合。我们检查了每位患者的 T1 加权矢状自旋回波图像（重复时间 (TR)=584 毫秒；回波时间 (TE)=6.6 毫秒；切片厚度=2.0 毫米；视场=25×25 厘米；矩阵=288×230；激励次数=8 (NEX)）和 T2 加权矢状快速自旋回波图像（TR=4017 毫秒；TE=100 毫秒重复时间；切片厚度=2.0 毫米；视场=25×25 厘米；矩阵=352×308；NEX=8）。 T2-star回波图像（TR=14.8毫秒；TE=多回波=3.57/4.93/6.29/7.65/9.0/10.36/11.72/13.08；切片厚度=3.0mm；视野=15×15cm；矩阵=152×144；NEX=4）。干细胞移植后立即进行MRI扫描。此外，在移植后两天、两周、一个月和七个月进行相同方案的全脊柱MRI检查。
移植后48小时，患者出现发热（体温：38～38.5℃）、头痛、肌痛，有短暂性神经功能障碍。美国脊髓损伤协会（ASIA）损伤量表显示所有关键肌肉均下降一级，次日早晨阴茎勃起功能障碍，但ASIA损伤量表显示感觉功能正常。体格检查未见颈部僵硬，全血细胞计数显示轻度白细胞增多。血培养结果为阴性。立即进行MRI扫描，未见明显变化。患者接受地塞米松静脉注射10mg，每6小时1次，共2天。地塞米松治疗后12小时内，患者神经系统状态恢复至移植前状态。移植后6个月，患者神经系统状态和呼吸功能均无变化。移植后12个月，患者身体两侧神经性疼痛加重。目前患者左侧疼痛仍重于右侧，呼吸功能无明显改变，仍需依靠呼吸机（表1）。
干细胞移植后立即进行了脊柱3.0特斯拉磁共振扫描。整个脊柱T2加权扫描和腰椎轴向T2加权扫描显示蛛网膜下腔和马尾区域有顺磁性物质标记的干细胞低信号强度，但在颈椎水平没有明显的低信号强度（图2）。48小时时，损伤的颈脊髓处有局灶性标记干细胞低信号强度；局灶性标记干细胞低信号强度在两周时消退，在两个月和七个月的MRI扫描中已消失（图3）。在任何后续MRI扫描中均未发现脊髓结构的变化。
图 2
通过腰椎穿刺技术进行干细胞移植一天后进行的颈椎磁共振成像扫描。他的整个脊柱的矢状 T2 加权扫描（A、B）和腰椎的轴向 T2 星扫描（C）显示腰椎蛛网膜下腔和马尾中的顺磁性物质标记干细胞信号强度较低。在颈椎水平未看到明显的顺磁性标记干细胞。（白色箭头；腰椎蛛网膜下腔中的低信号强度）。
图 3
移植前（A），干细胞移植两天后（B），两周后（C），一个月后（D）和七个月后（E）对其颈椎 C1 水平进行轴向 T2 星回声 5 磁共振成像扫描的时间线。干细胞移植两天后进行的轴向 T2 星扫描（B）显示，在病理上颈髓表面（箭头）有标记干细胞的局灶性低信号强度，干细胞移植两周后进行的轴向 T2 星扫描显示标记干细胞的局灶性低信号强度减弱（C），在一个月和七个月的扫描中消失。
讨论
鞘内移植是脊髓损伤干细胞移植中创伤较小的方法之一。据我们所知，这是第一个在慢性脊髓损伤中显示出从腰椎鞘内移植到颈部的干细胞迁移的临床人类病例。在腰椎水平进行鞘内移植后，可以通过对受伤的颈脊髓进行连续 MRI 扫描来检测到 SPION 信号。
在之前的临床研究中，鞘内干细胞移植主要侧重于临床结果（运动功能改善、感觉功能改善或电生理学）[12,17,18]。只有 Callera 和 de Melo [19] 的一份报告评估了鞘内移植后自体骨髓 CD34+ 细胞（用磁珠进行细胞外标记）的迁移情况。该研究检测到慢性损伤脊髓处有低信号，但迁移的细胞无法到达损伤的颈脊髓 [19]。然而，在我们的病例中，移植的细胞可以到达损伤的颈脊髓。我们的患者在移植后 24 小时内处于特伦德伦堡体位，这可能是细胞从腰椎落到颈部的原因；这是否是细胞向上迁移的原因还有待进一步研究。
使用 MRI 追踪 SPION 标记细胞是基于磁性粒子的使用。该技术可直接定位移植细胞 [20]。MRI 检测到的信号强度可轻松识别并与成像解剖学相关联；这对于评估移植过程的有效性非常有利 [21]。然而，无法使用这种直接细胞标记技术评估 BMSC 的活力和功能 [22]。MRI 检测到的 SPION 标记的低信号强度无法区分活细胞
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