129VV 纯合散发性克雅氏病中蛋白酶敏感和抗性朊病毒蛋白共存：一例病例报告
抽象的
已经描述了同一个体中不同分子类型的经典蛋白酶抗性朊病毒蛋白的共存，然而，据我们所知，同时发现这些分子类型的朊病毒蛋白与最近描述的蛋白酶敏感变体或可变蛋白酶敏感性朊病毒病的情况尚未见报道。
一名 74 岁的白人女性表现出偶尔出现的克雅氏病临床表型，伴有反应性抑郁症，随后出现认知障碍、运动不能性僵硬性帕金森病和假性延髓综合征，以及运动性失用症、视觉空间定向障碍和明显的额叶功能障碍，如抓握、掌颏反射和活跃的口周反射。她于 77 岁去世。
神经病理学检查结果显示：患者大脑皮层、纹状体、丘脑和小脑分子层呈海绵状改变，皮层、丘脑和纹状体中有蛋白酶K敏感的突触状、点状或靶状朊病毒蛋白沉积；上述区域有蛋白酶K抗性朊病毒蛋白；小脑分子层中有细长的斑块状蛋白酶K抗性朊病毒蛋白。蛋白酶K消化后朊病毒蛋白的分子分析显示免疫印迹信号强度降低，蛋白质模式呈阶梯状，与未消化物质相比，PrPSc信号降低71%。她的小脑显示对蛋白酶K有很大抗性的2A朊病毒蛋白类型。密码子129的多态性基因型为缬氨酸纯合。
据我们所知，朊病毒蛋白的分子分型以及临床和神经病理学数据显示，这是首例在同一患者体内同时存在不同蛋白酶敏感朊病毒蛋白的罕见病例，该病例不符合目前临床诊断标准，即可能或可能散发性克雅氏病。这凸显了对多个脑区进行分子分析对于正确诊断罕见和非典型朊病毒病的重要性。
介绍
朊病毒病是一种致命的神经退行性疾病，其特征是细胞内异常的朊病毒蛋白（PrP）亚型积聚。正常生理性蛋白质与异常病理性蛋白质之间的主要区别在于它们的物理和化学性质，特别是它们的去污剂溶解度、二级结构中 α-螺旋和 β-片层含量以及对蛋白酶消化的抵抗程度。
最近，一种新型散发性朊病毒病被报道出来，被称为可变蛋白酶敏感性朊病毒病（PSPr 或 VPSPr）[1]。迄今为止，这种类型的病例在世界范围内很少见[1–6]，在美国，据估计占散发性克雅氏病（sCJD）的 3%[1]。然而，必须考虑到，一些病例可能最初被误诊为其他朊病毒病表型，如 sCJD[2,5] 或非典型阿尔茨海默病或 Gerstmann–Sträussler–Scheinker 综合征[4]，而且实际患病率可能更高，因为 PSPr 病例可能被错误地归类为非阿尔茨海默氏痴呆症组[1]。在这种新型 sCJD 变体中，描述了具有三种受影响的 129 多态性基因型的病例 [4–6]，这些病例均表现出对蛋白酶 K (PK) 降解的更高 PrP 敏感性和蛋白质印迹上的阶梯状带模式等所有区别性特性。
在 sCJD 中，一个常见的现象是不同 PrP 经典 PK 抗性类型在相同或不同的脑区共存 [7–15]。然而，据我们所知，同一 PSPr 患者中不同抗性 PrP 类型共存的情况尚未见报道 [1,2,4,6]。
这里我们描述了第一例 sCJD 129VV 病例，其中存在不同蛋白酶敏感 PrP 类型共存。
病例介绍
一名 74 岁的白人女性，最初患有抑郁症，病史 36 个月，认知障碍进展缓慢。既往病史显示有高血压和白内障手术。没有记录关于痴呆症家族史的信息。九年前，在哀悼配偶和其他亲属去世时，她患上了抑郁症，被认为是反应性抑郁症，未得到治疗。在接下来的几个月里，她表现出精神迟钝和言语障碍，但没有行为障碍或明显的记忆丧失。十个月后，在她还能独立生活并能照顾孙子孙女的时候，她第一次去看神经科医生。神经系统检查发现她精神迟钝、面容抑郁、轻微的构音障碍、单调和语调紊乱。她很合作，对时间和空间有定向能力，但她笨拙地遵循指示。她无法书写（她识字率低），并表现出手势意念运动失用症，她的焦虑使检查变得困难。无运动不能-强直综合征或肌束震颤。整体检查除收缩期主动脉杂音外未发现其他异常。
患者的临床表现被解释为反应性抑郁症，此外还有单独的语言障碍，其特征是假性延髓性言语，这导致医生推测该患者患有额叶退行性疾病。当时医生既没有怀疑患有伴有认知障碍的帕金森病，也没有怀疑患有阿尔茨海默病。患者没有进行性核上性麻痹或运动神经元病的主要特征。其他检查包括头颅 MRI 显示双侧额顶叶和小脑半球萎缩，维生素 B12、叶酸和甲状腺激素水平的实验室检查结果正常，以及超声心动图显示轻度主动脉瓣关闭不全。医生开始使用帕罗西汀 (20 毫克/天) 治疗。一个月后，新的检查显示语言障碍恶化。患者的临床表现与进行性退行性认知障碍相符，因此医生怀疑该患者患有阿尔茨海默病或额颞叶痴呆。在随后的几个月中，病情不断恶化，影响步态并导致多次摔倒，包括六个月后的肱骨骨折。当时进行的头颅单光子发射计算机断层扫描显示左侧额叶皮层减退更为明显，并延伸至双侧颞叶。初次就诊三个月后进行的第一次脑电图 (EEG) 显示正常，五个月后的第二次脑电图显示全身缓慢活动。随后患者病情突然恶化，出现伴有假性延髓综合征的运动不能性僵硬性帕金森病和步态障碍，伴有运动失用、视觉空间失调和明显的额叶功能障碍特征，如抓握、掌颏反射和活跃的口周反射。当时无法进行感觉检查。鉴别诊断包括路易体痴呆、皮层基底神经节变性或朊病毒病。患者住院进行腰椎穿刺；她的脑脊液检查显示两个细胞具有正常的生化和微生物学参数，包括 14-3-3 测试阴性、抗伯氏疏螺旋体血清学和快速血浆反应素 (RPR) 测试。从那时起，在接下来的 25 个月里，患者一直住院在家。然后她因肺炎被送往医院。当时她完全依赖他人，患有失禁和运动不能性缄默症样综合症。两个月后她去世了。已获得患者亲属的知情同意进行尸检。
尸检在死后 24 小时内进行，并从 9 个位置采集样本，一式两份，进行组织病理学和分子处理。简而言之，每个样本都用 4% 福尔马林固定，用甲酸处理并嵌入石蜡中。切片用苏木精和伊红染色或进行 PrP 免疫组织化学处理，有或没有 PK 预处理。冷冻非固定样本进行免疫印迹以进行条带模式识别，并进行比较酶联免疫吸附试验 (ELISA) 以进行 PK 敏感性分析，如前所述 [5]。
大脑皮层上层（图1A）和内层（图1D）均出现海绵状改变，包括额叶和颞叶皮层、内嗅皮层和下托。纹状体和丘脑出现中度海绵状改变。PrP 免疫反应遵循突触模式，并伴有点状（根据 Zouet al. [6] 的命名法为靶状）沉积，尤其是在深层皮层中。PrP 沉积大部分对 PK 治疗敏感，但大多数靶状沉积对 PK 治疗有抗性（图1B、1C、1E、1F）。未见神经元周围 PrP 免疫反应性沉积。
图 1
免疫组织学（A-L）和免疫印迹（M-N）结果。AC：额叶皮质；DF：颞叶皮质；GL：小脑。额叶（A）和颞叶（D）皮质以及小脑分子层（G，H）的海绵状变化伴有皮质（A，D）中度神经元丢失和小脑颗粒层（I）的鱼雷状结构。大脑皮质和小脑中可见 PrP 免疫反应性（PrP-ir）沉积物（B，E，J）。蛋白酶 K（PK）处理后，大脑皮质中的 PrP-ir 大幅减少，但有小的 PrP-ir 点呈点状或靶状图案（C，F）。相比之下，小脑分子层中的 PrP-ir 以细长的斑块状沉积物的形式在 PK 处理后得以保留（K，L）；颗粒层内无PrP斑块。石蜡切片：A、D、G、H：HE染色；I：磷酸化神经丝免疫组化；B、C、E、F、JL：PrP免疫染色（3F4抗体），未用（B、E、J）和用（C、F、K、L）PK处理。A、D、G、J、K、L：×200（L中的条形图，100μm）；B、C、E、F、H、I：×400（I中的条形图，50μm）。 PK 按照供应商的指示使用：将 1 滴 PK 浓缩液（DAKO，S2019）加入 1.6 mL DAKO ChemMate TM PK 稀释液（S2032）中，反应 15 分钟。M：常规免疫印迹条件（10% 脑匀浆和最终 PK 浓度为 440μg/mL）如其他地方所述 [5]，胶片曝光时间为五分钟。 PK 预处理的大脑区域对应于枕叶皮质（泳道 1）、壳核/苍白球（泳道 2）、小脑（泳道 3）、顶叶皮质（泳道 4）、丘脑（泳道 5）、额叶皮质（泳道 6）、颞叶皮质（泳道 7）、散发性克雅氏病 (sCJD) VV2 参考病例枕叶皮质（泳道 8）。N：在较不严格的条件下 (TeSeE® Western Blot Kit, Bio-Rad) 对 PK 预处理样品进行免疫印迹，并使用 3F4 抗体 (Dako, 稀释度 1:3000) 进行检测，如前所述 [5]，胶片曝光时间为 10 分钟。脑区对应枕叶皮质（泳道 1）、小脑（泳道 2）、顶叶皮质（泳道 3）、丘脑（泳道 4）、额叶皮质（泳道 5）、颞叶皮质（泳道 6）、可变蛋白酶敏感性朊病毒病 129MV 顶叶皮质（泳道 7）[5] 和 sCJD VV2 参考病例额叶皮质（泳道 8）。分子量标准以 kDa 表示：(M) SDS-PAGE 标准品，宽范围，Bio-Rad 和 (N) Precision Plus 蛋白未染色标准品，Bio-Rad。
小脑分子层出现海绵状改变，浦肯野细胞适度丢失，偶尔出现轴突鱼雷（图 1G-I）。PrP 免疫组织化学显示分子层中有细长的斑块状沉积物，这些沉积物对 PK 预处理有抵抗力（图 1J-L）。小脑颗粒层中常见的斑块状沉积物（在 sCJD VV2 中常见）没有出现。
伴随的发现是内嗅皮质、下托、海马、颞下皮质以及罕见的额叶皮质中存在神经原纤维缠结，大脑皮质中存在弥漫性和神经性 β-淀粉样斑块，与 Braak 的神经炎阶段 VB 中与阿尔茨海默病相关的变化相对应。
使用从新鲜脑组织提取的基因组 DNA，通过聚合酶链式反应 (PCR) 扩增整个 PRNP 开放阅读框。PCR 在 25μl 的最终体积中进行，其中包含 45ng DNA、0.1mM dNTP、1mM MgCl2、每种引物 0.2μM（正向：5′-CCATTGCTATGCACTCATTC-3′；反向：5′-CGGGACAAAGAGAGAAG
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