ARID1 基因组改变通过体细胞 MLH1 甲基化驱动微卫星不稳定性并对转移性肺腺癌的免疫治疗产生反应：病例报告
抽象的
肿瘤分子筛查可以对分子改变进行分类，以选择最佳治疗策略。富含 AT 的相互作用结构域 1A (ARID1A) 基因突变存在于胃癌、子宫内膜癌和透明细胞卵巢肿瘤中。该基因的失活会损害错配修复 (MMR) 机制，导致突变负担增加，与微卫星不稳定性 (MSI) 相关，与肿瘤浸润淋巴细胞和程序性死亡配体 1 (PD-L1) 表达有关。这是肺腺癌中第一例 ARID1A 基因改变导致散发性 MSI 的病例报告，通过体细胞 mutL 同源物 1 (MLH1) 启动子甲基化，以 MLH1 基因突变作为第二个体细胞突变。
一名 50 岁的保加利亚女性，从不吸烟，无合并症，无癌症家族史，被诊断出患有转移性肺腺癌。右腹股沟腺病组织活检的 PD-L1 免疫组织化学 (IHC) 结果显示阳性率为 30%。液体活检测试报告了可操作的改变：ARID1A 基因、转染过程中重排 (RET) 基因融合、表皮生长因子受体 (EGFR) 基因 R776H 突变、乳腺癌 (BRCA) 基因 1/2 和细胞周期蛋白依赖性激酶抑制剂 2A (CDKN2A) 基因突变。患者接受了免疫疗法治疗，治疗反应持续 19 个月，直到右侧三角肌出现新的转移。对该转移样本的基因组分析证实，PD-L1 阳性率超过 50%，CD8+T 细胞表达，并显示 MSI 和有害的 c.298C>T (p.R100*)MLH1 基因突变。对该样本进行多重连接依赖性探针扩增 (MLPA) 发现 MLH1 基因启动子甲基化。MLH1 基因突变和 MLH1 基因甲基化在种系环境中不存在。
在这一特殊病例中，我们表明，由于体细胞MLH1基因启动子甲基化和MLH1基因突变导致的ARID1A基因突变和散发性MSI可能会改变肺腺癌患者的预后并决定其对免疫疗法的反应。全面的固体和液体活检测试有助于找出对免疫检查点抑制剂的耐药机制。我们的数据鼓励开发针对ARID1A突变和表观基因组甲基化的新疗法，这些疗法涉及MSI肿瘤。
介绍
肿瘤分子筛查可以对分子改变进行分类，以选择最佳治疗策略。靶向药物对晚期肺腺癌具有显著而持久的疗效。在缺乏这些特定生物标志物的情况下，全身免疫检查点抑制剂对具有其他生物学特征的肿瘤也有效：微卫星不稳定性 (MSI)、高肿瘤突变负担 (TMB) 或程序性死亡配体 1 (PD-L1) 表达。确定免疫治疗反应的分子机制有助于临床医生选择这种治疗方法。已知富含 AT 的交互式结构域 1A (ARID1A) 基因突变发生在胃、子宫内膜和透明细胞卵巢肿瘤中。该基因失活会损害错配修复 (MMR) 机制，导致与 MSI 相关的突变负担增加，与肿瘤浸润淋巴细胞和 PD-L1 表达有关。这是肺腺癌中第一例ARID1A基因变异导致散发性MSI的病例报告，通过体细胞MLH1启动子甲基化，以MLH1基因突变作为第二个体细胞突变，显示出对免疫检查点抑制剂的临床和放射学反应。
案例描述
一名 50 岁的保加利亚女性，从不吸烟，无合并症，无家族癌症史，2015 年 6 月经体格检查和计算机断层扫描 (CT) 扫描显示患有 IV 期肺腺癌，已转移至腹膜、腹膜后、肾上腺、髂骨和腹股沟淋巴结。原发性肿瘤和右腹股沟腺病的组织活检显示腺癌，细胞角蛋白 7 (CK7)、上皮膜抗原 (EMA)、甲状腺转录因子 1 (TTF-1) 免疫组织化学 (IHC) 染色呈阳性，细胞角蛋白 20 (CK20) 染色呈阴性。实时聚合酶链式反应 (RT-PCR) (COBAS 4800 系统) 显示无表皮生长因子受体 (EGFR) 或 v-RAF 鼠肉瘤病毒致癌基因同源物 B (BRAF) 基因 V600E 突变。荧光原位杂交 (FISH) 未检测到间变性淋巴瘤激酶 (ALK) 基因融合、原癌基因 1 受体酪氨酸激酶 ROS (ROS-1) 基因重排或酪氨酸蛋白激酶 Met (肝细胞生长因子受体) (MET) 基因扩增。2015 年 7 月，她开始接受顺铂联合培美曲塞化疗，因双侧肾上腺转移而出现肾上腺功能不全，需要补充糖皮质激素和盐皮质激素。四个周期后，根据实体肿瘤疗效评价标准 (RECIST) 1.1 版获得部分缓解 (PR)。在用培美曲塞维持治疗 12 个周期后，2016 年 7 月在腹膜后和肾上腺记录到放射学进展性疾病 (PD)。2016 年 8 月和 2016 年 9 月，给予了三个周期的多西他赛，仅在左肾上腺出现转移。
随着 ChekMate057 结果 [1] 的出现，免疫疗法被提出。右腹股沟腺病的 PD-L-1 IHC（DAKO 22C3 抗体）阳性率为 30%，肿瘤样本已耗尽。为了确保患者没有任何可操作的基因组变异，进行了全面的液体活检 Guardant360 测试。它报告了 97 种基因组变异，其中 19 种可操作变异（ARID1A 基因 6 种，RET 融合，EGFRR776H 突变，BRCA1/2 和 CDKN2A 突变）（表 1）。
PD-L1 阳性推断为超突变表型，在患者同意的情况下，支持选择免疫疗法。Nivolumab 3 mg/kg 静脉注射，每 2 周一次，共注射 38 个周期。七个周期后，根据癌症免疫治疗试验中的 RECIST (iRECIST) 获得 PR (iPR)。从 2016 年 12 月到 2018 年 9 月，免疫治疗维持了 19 个月，通过右侧三角肌新转移的实体活检进一步证实了 PD iRECIST (iCPD)（图 1）。
图 1
疾病反应。a 7 个周期的 nivolumab 治疗后，根据实体瘤疗效评估标准（在癌症免疫治疗试验中）显示部分反应，右肾上腺转移消失，左肾上腺肿块缩小。b 右侧三角肌出现新转移（根据实体瘤疗效评估标准（在癌症免疫治疗试验中）确认为疾病进展），再次接受顺铂联合培美曲塞治疗后消失。蓝色箭头指向右侧肾上腺转移。红色箭头指向左侧肾上腺转移。黄色箭头指向右侧三角肌转移
该转移瘤样本进入跨国前瞻性分子筛查项目 ARCHE（比利时 OncoDNA S.A.），进行 OncoDEEP™ 综合检测，检测 76 个基因和个性化肿瘤免疫图谱。在右侧三角肌转移瘤中，该平台通过 IHC 显示 PD-L1 阳性率大于 50%，CD8+T 细胞表达，并显示 MSI，伴有有害的 c.298C>T (p.R100*) mutL 同源物 1 (MLH1) 基因突变（变异等位基因频率 [VAF] 30%）（表 2）。
2018 年 12 月，自 2018 年 10 月起重新开始使用顺铂联合培美曲塞，获得部分缓解（图 1），但不久后病情出现进展。再次使用免疫疗法和使用长春瑞滨均未成功。
讨论
ARID1A 基因突变发生在多种肿瘤中：胃癌、子宫内膜癌和透明细胞卵巢癌。ARID1A 缺乏形成的肿瘤突变率增加，肿瘤浸润淋巴细胞和 PD-L1 表达增加 [2]。利用新一代测序 (NGS) 发现，肺腺癌样本中 ARID1A 基因突变的患病率为 8% [3]。在西班牙的 185 名未接受治疗的患者队列中，用 Guardant360 分析的 12% 晚期肺腺癌无细胞脱氧核糖核酸 (cfDNA) 样本含有 ARID1A 突变（61% 致病/可能致病）[4]。迄今为止，尚无明确的流行病学、临床病理学或分子特征与 ARID1A 突变的肺腺癌有明确关联。
在我们的患者中，PD-L1 阳性率为 30%，存在 97 个基因组改变（五个不同的外显子缺失和一个 ARID1A 基因突变，占改变的 cfDNA 的 33.6%）（表 1），这使我们估计 ARID1A 畸变是驱动事件。
大多数 ARID1A 突变都会失活，导致 ARID1A 表达丧失，因此不易用药。然而，ARID1A 缺乏对癌症的分子影响可能在治疗上得到利用。ARID1A 与 MMR MutS 蛋白同源物 2 (MSH2) 相互作用，在脱氧核糖核酸 (DNA) 复制期间募集 MSH2 到染色质，并促进 MMR。相比之下，ARID1A 失活会损害 MMR 机制，导致与 MSI 相关的突变负担增加 [2]。
在 12 种不同组织学的 MMR 缺陷型癌症中，使用抗 PD-1 抗体派姆单抗后观察到总缓解率 (ORR) 为 53% (48/86) (95% CI 42–64)，21% 的患者完全缓解 (CR)，2 年总生存率 (OS) 为 64% [5]。抗 PD-1 抑制剂 nivolumab 在 42 名接受过治疗的 MMR 缺陷型肿瘤患者中显示 ORR 为 36%（7% CR）[6]。然而，这些研究未包括非小细胞肺癌 (NSCLC) 患者。
ARID1A 突变与微卫星稳定 (MSS) 肿瘤中更高的 TMB 相关（中位数为 17.6 突变/Mb 对比 7.4 突变/Mb，p< 0.001）[7]。相反，在我们患有 MSI 的肿瘤中，突变表型可能是由 ARID1A 驱动变异引发的，这种变异会损害 MSH2 募集以进行 DNA 修复，而最初并未检测到/不存在 MMR 基因突变，并且由于 MMR 缺陷而存在免疫治疗反应。
然而，ARID1A 也被描述为通过表观遗传沉默 MLH1 基因而导致 MSI 的致病基因。ARID1A 表达的缺失与子宫内膜癌中继发于 MLH1 基因启动子甲基化的散发性 MSI 有关 [8]。由于 Guardant360 不具备分析表观基因组变化的功能，我们推测 ARID1A 驱动基因改变也可能促使我们患者出现这种散发性 MSI 表观基因组途径，从而导致高突变率。
三角肌肿瘤样本中的 OncoDEEP 综合面板证实了疑似 MSI，存在致病性 MLH1 基因突变。在具有 MSI 的散发性结肠肿瘤中，MLH1 甲基化与 BRAFV600E 突变之间存在高度但不完全的相关性 [9]。同样，BRAFV600E 突变的缺失不能明确排除该肺腺癌中的 MLH1 甲基化。我们继续研究 MLH1 基因启动子甲基化（SALSA MS-MLPA Probemix ME011-C1 错配修复基因），并在三角肌转移中发现了其存在（图 2）。
图 2
mutL 同源物 1 (MLH1) 甲基化研究的 Genmapper。a 上图：血

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