霍乱流行地区发生气单胞菌性霍乱弧菌感染性肠病，可能造成公共卫生后果：两例病例报告
抽象的
据记载，气单胞菌属在霍乱弧菌的微生物检测中会产生假阳性结果。它们与弧菌属有许多相同的生化特性，因此它们被归类为弧菌科，直到基因型信息提供了新的见解。气单胞菌属越来越多地与胃肠道感染有关，尽管该属的物种之间和物种内部的致病性和毒力明显存在很大差异。我们报告了两例临床症状轻微的霍乱样病例，当时该国其他地区（坦桑尼亚）正在爆发霍乱。这是我们地区首次报告的霍乱样气单胞菌病例。
两名患者被送往乞力马扎罗基督教医疗中心指定的新发传染病隔离病房，并在临时诊断为胃肠炎的情况下，知情同意定期进行粪便分析和培养。第一名患者是一名 23 岁的黑人非洲女性，有 2 天的水样腹泻和呕吐病史，体温为 39.7°C。第二名患者是一名 47 岁的黑人非洲女性，有 2 天的腹泻和呕吐病史，体温为 37.7°C，血流动力学稳定。两名患者都被隔离在特定的感染控制区域，并用液体和口服补液盐、环丙沙星、甲硝唑和对乙酰氨基酚治疗。进行了粪便培养。分离的菌落被报告为霍乱弧菌，并转移到乞力马扎罗临床研究所的研究实验室，通过全基因组测序进行确认。微生物学检测确定从粪便中分离的菌落为霍乱弧菌。霍乱弧菌，并因此得出结论“推测为霍乱”。然而，全基因组测序证实了豚鼠气单胞菌的存在，而不是霍乱弧菌。
在霍乱流行地区，气单胞菌与霍乱弧菌共存，表明部分霍乱疑似病例可能是气单胞菌感染。然而，由于几乎没有关于撒哈拉以南非洲腹泻和痢疾病例中气单胞菌感染的流行病学数据，目前无法确定误诊的程度。全基因组测序显示，可以很容易地排除霍乱弧菌作为病原体，并确定气单胞菌的存在。
背景
检测气单胞菌种，尤其是将其与弧菌种区分开来，可能需要进行大量的实验室检测 [1,2,3]。我们被这个问题困扰了，因为在同一天，两名患者出现了类似霍乱的症状，而当时该国（坦桑尼亚）其他几个地区正在爆发大规模霍乱疫情。我们将此病例报告作为一个警示故事，可能与霍乱疫情的管理有关。在获得了分离株的全基因组序列后，我们也希望为越来越多的将气单胞菌与人类肠病联系起来的证据做出微薄的贡献。
2015 年，坦桑尼亚经历了两次大规模霍乱疫情。在坦桑尼亚与布隆迪边境的一个难民营中，已报告 4833 例病例，其中 40 例死亡 [4]。2015 年 8 月 15 日，达累斯萨拉姆出现了一例新的指示病例。我们的病例出现在 2015 年 9 月 8 日，当时全国已报告 857 例病例和 13 例死亡。到 10 月，疫情已蔓延到 13 个地区，累计病例数为 4835 例 [5,6]。当疫情在 2016 年 4 月缓解时，28 个地区共报告了 24,018 例病例，其中 429 例死亡 [7]。
霍乱是一种急性腹泻感染，由摄入被霍乱弧菌污染的食物或水引起。霍乱是一种可能致命的疾病，会影响成人和儿童，如果不及时治疗，可能会在数小时内死亡。霍乱弧菌的 O1 和 O139 血清群会引起疫情；其他菌株可引起轻度腹泻，但不会引起流行病。大约 80% 的霍乱弧菌感染者不会出现症状；但他们可以在长达 10 天内排出细菌。在出现症状的人中，80% 有轻度或中度症状，而约 20% 会出现急性水样腹泻和严重脱水 [8]。
气单胞菌属与多种人类传染病有关，包括胃肠炎、伤口感染、败血症、呼吸道感染、肝胆感染和尿路感染 [3,9]。气单胞菌病最常与胃肠道感染有关。大多数气单胞菌相关肠病是水样腹泻，病程具有自限性；但也可能出现发烧、腹痛、呕吐、血性腹泻和继发性脱水。气单胞菌相关肠病的暴发很少见。在一次涉及 2170 例的腹泻暴发中，气单胞菌是分离最普遍的单一肠道病原体 (82%)，但霍乱弧菌菌株 O1 也在 12% 的样本中分离出来，并被确定为更可能的病原体 [10]。
气单胞菌在水生环境中普遍存在。研究表明，弧菌和气单胞菌共栖于一个宿主。摇蚊是水生环境中数量众多的昆虫 [11]，被认为是弧菌和气单胞菌的天然宿主 [12]。
人们对撒哈拉以南非洲 (SSA) 地区气单胞菌相关胃肠炎的发病率知之甚少。在亚洲、拉丁美洲和非洲的一些国家开展的研究发现，腹泻儿童中 1% 至 80% 分离出气单胞菌，无症状儿童中 0% 至 45% 分离出气单胞菌 [13]。最近的大规模全球肠道多中心研究 (GEMS) [14] 发现，气单胞菌感染与孟加拉国和巴基斯坦 5 岁以下儿童的水样腹泻和痢疾显著相关，但未发现印度或研究中的四个 SSA 国家的地点存在显著的归因风险。在孟加拉国和巴基斯坦，研究发现中度至重度腹泻儿童粪便中气单胞菌含量为 18.7% 至 28.6%，通常伴有肠道病原体共感染。仅在 1.8% 至 4.2% 的病例中，它被发现是唯一的病原体。在大约相同数量的病例和匹配的对照者的粪便中检测到了气单胞菌[14,15,16]。
气单胞菌相关性腹泻的流行病学受宿主和环境因素以及菌株间致病性差异的影响 [17,18]。研究表明，分离株在毒力基因存在方面存在很大差异，无论是在物种间还是在物种内 [17,19,20]。
直到 20 世纪 80 年代，气单胞菌属和弧菌属被归类为弧菌科。随后，分子遗传学的发展导致气单胞菌被重新归类为气单胞菌科。此后，该属内又进行了几次重新分类。至少有 31 种已知或拟议的气单胞菌被描述，表现出很大的表型多样性 [17]。与人类肠道病理学相关的主要菌种是豚鼠气单胞菌、嗜水气单胞菌和维氏气单胞菌温和生物变种，尽管研究对这些菌种在人类感染中的相对重要性存在分歧 [13,21,22,23,24]。
为了将气单胞菌与其以前的家族成员霍乱弧菌和类志贺邻单胞菌（均呈氧化酶阳性，与肠杆菌科不同）区分开来，关键的筛选反应包括：在有盐和无盐的营养肉汤中生长；在硫代硫酸盐-柠檬酸盐-胆汁盐-蔗糖 (TCBS) 琼脂上生长（对具有圆形黄色或绿色 > 2 毫米菌落的霍乱弧菌有选择性，对没有或具有微小菌落的气单胞菌有抑制作用）；对弧菌抑制剂 O/129 有抗性；以及细绳试验 [3]。Ghenghesh 等人 (2008) 记录了所需资源最少的实验室程序，可在资源匮乏的环境中应用 [13]。据记录，气单胞菌菌株在各种检测中都会表现出异常结果，在极少数情况下“如果没有进行完整的筛查测试，可能会被误认为是霍乱弧菌” [1]。 2015 年，英国公共卫生部扩大了弧菌种鉴定标准，包括气单胞菌种的鉴别程序 [25]。
基因组数据可轻松准确地将分离物鉴定为气单胞菌属的成员，尽管由于多种因素，按物种等级进行分类很复杂。通过与公开存放的基因组进行比较进行分类，即使在精选数据库中，也可能导致错误标记 [22]。这在一定程度上是由于该属内的后验重新分配，但也是气单胞菌生物学所固有的。该属成员之间经常发生重组，从而形成“基因转移高速公路”，掩盖了垂直系统发育 [26]。此外，气单胞菌种的核糖体 RNA (rRNA) 基因具有异常高的拷贝数和巨大的基因组内异质性，不符合 16S rRNA 基因身份的常见鉴定方法 [27,28,29]。
鉴于气单胞菌的复杂分类，通过电子计算机DNA-DNA杂交和平均核苷酸同一性（ANI）测量的全基因组内容比较已被提议作为鉴定的“新金标准”[22,26]。利用保守的管家基因gyrB、rpoD、recA、dnaJ、gyrA和dnaX进行电子计算机多位点序列分型（MLST）已被证明可以准确地重现气单胞菌物种的分类[30]。
对于临床目的而言，详细鉴定可能不如确定生物体的毒力和药物敏感性特征那么重要，尤其是当这些特征与物种无法完全区分时。全基因组测序 (WGS) 的优势在于，只要机制已经进行基因分型，就可以提供数据来分析两者。此外，WGS 还可以提供前所未有的疾病爆发动态洞察。
霍乱几乎每年都会爆发，是坦桑尼亚和许多其他撒哈拉以南非洲国家的地方性疾病。其病原体霍乱弧菌与表型相似但基因型不同的气单胞菌属物种共存于同一地区。轻度至重度传染性胃肠炎的临床病例可能是由气单胞菌的毒性菌株引起的，尽管人们对其在撒哈拉以南非洲的发病率知之甚少。霍乱弧菌的实验室检测在对气单胞菌物种进行检测时可能会产生假阳性结果。因此，可能需要进行高级检测（在资源匮乏的环境中通常无法进行）来确定气单胞菌感染，正如本病例报告旨在说明的那样。
病例介绍
两名患者被收治在坦桑尼亚莫西一家转诊医院指定的新发传染病疫情隔离病房，该医院是一家三级转诊医院和学术培训中心。这两名患者知情同意定期进行粪便检测以诊断传染性胃肠炎，并同意对样本进行进一步的基因组研究分析。
第一位患者是一名 23 岁的黑人非洲女性，有 2 天的腹泻和呕吐病史。入院前一天，她在一家餐馆吃了炸肉小吃。当晚晚些时候，她出现了十多次严重的黄绿色水样腹泻，伴有绞痛性腹痛，仅呕吐过一次。经检查，她看上去病怏怏的，但很警觉，没有脱水，血流动力学稳定，发烧 39.7 °C。
第二名患者是一名 47 岁的黑人非洲女性，腹泻和呕吐病史已持续 2 天。她直接从家里赶来，吃了正常的一餐，包括肉、乌加利（一种淀粉类食物）和蔬菜，像往常一样准备食物。她曾十多次出现大量水样腹泻，颜色呈绿黄色，伴有绞痛性质的全身腹痛，并呕吐了五次。经检查，她看上去病怏怏的，神志清醒，没有脱水，体温为 37.7 °C，血流动力学稳定。两名患者都被隔离在特定区域以控制感染，并接受输液和口服补液盐、环丙沙星、甲硝唑和对乙酰氨基酚治疗。
在两名患者中，粪便分析和培养均在暂时诊断为胃肠炎的情况下进行。乞力马扎罗基督教医疗中心 (KCMC) 的两名患者的粪便样本接受了一系列标准检测，这些检测在 KCMC 临床实验室中对疑似传染性胃肠炎病例进行了常规检测。粪便显微镜检查采用革兰氏染色和湿制剂进行运动性检测。将直肠拭子放入碱性蛋白胨水 (APW；Sigma；德国 Steinheim) 中进行富集，并在 37 °C 下孵育 18 小时。然后将富集的样本传代培养到 TCBS 琼脂 (Sharlau，西班牙) 上。在 37 °C 下培养 24 小时后，疑似霍乱弧菌的黄色菌落（蔗糖发酵，直径 2-3 毫米）经革兰氏染色（革兰氏阴性逗号状杆状菌）鉴定，并进行生化检测，结果为阳性氧化酶反应、尿素水解、柠檬酸发酵、硫还原和硫化物吲哚运动 (SIM) 培养基中的吲哚生成。对病例 2 的一个分离株进行了多价 O1 抗血清凝集试验的血清学分型。未进行 Inaba 和 Ogawa 血清凝集试验。结果总结在表 1 中。
分离出的菌落被报告为疑似霍乱弧菌，但由于证据不确凿且与临床表现不符，因此需要进行确认性检测。用药改为强力霉素，再用 3 天。患者病情进展良好，再次采集粪便样本进行随访分析。两名患者的全血细胞计数基本正常。
分离株被转移到乞力马扎罗临床研究所 (KCRI) 的研究实验室，通过 WGS 进行确认。KCRI 是与转诊机构联络的研究机构，拥有东非为数不多的下一代测序仪之一。在这里，分离株被传代培养到 TCBS 琼脂平板上，并在 37°C 下孵育 24 小时。来自 TCBS 的菌落用于基因组 DNA 提取。使用 MasterPure™ 完全 DNA 和 RNA 纯化试剂盒 (Epicentre, Illumina Inc.) 提取基因组 DNA。使用 Qubit 2.0 荧光计 (Invitrogen, Life Technologies) 评估基因组 DNA 的质量和数量。使用 Nextera XT DNA 制备试剂盒 (Illumina Inc.) 进行 DNA 文库制备 (双重索引)。文库的 WGS 在 Illumina MiSeq (Illumina Inc., 美国圣地亚哥) 上使用 2 x 250 bp 双端协议进行。
使用 KCRI 的 WGS 研究标准流程对测序仪读数进行初步基因组分析。该流程由丹麦技术大学基因组流行病学中心的免费在线服务的本地实例构建而成（https://cge.cbs.dtu.dk/services/）。该流程依次执行：从原始读数中识别物种（KmerFinder 1.1）；新基因组组装和质量评估（SPAdes 3.5、Quast 2.3）；16S rRNA 物种分型（SpeciesFinder 1.2）；多位点分型（MLST 1.8）；以及抗菌素耐药性预测（ResFinder 1.3）。还进行了其他分析以消除流程输出的歧义，并研究毒力基因（BLAST 2.2）。
测序仪运行产生的产量低于平均水平（平均碱基覆盖率为 10.4），因此从头组装导致基因组组装碎片化。两个样本都产生了大约 450 个重叠群，最大的重叠群约为 90 kbp，N50 大小约为 20 kbp。这影响了下游分析的鉴别能力，并妨碍了详尽的系统发育分析，但足以满足物种鉴定的临床目的。
KmerFinder 结果最终排除了霍乱弧菌，并将分离物确定为气单胞菌属，最有可能是嗜水气单胞菌种。SpeciesFinder 未能对组装体进行 16S 分型，这可能是由于气单胞菌具有较高的 16S rRNA 基因拷贝数，而长重复序列给基因组组装带来的问题加剧了这一问题。然后针对手工整理的 GreenGenes 16S 和 SILVA SSU/LSU 参考数据集进行分型。两者都没有提供比气单胞菌属更具体的分类分配。随后将组装体与 NCBI 16SMicrobial 数据库进行局部比对，并手动整理匹配的重叠群，产生了与两种分离物都匹配的序列 A. caviae（GenBank 序列 NR_104824.1）。
通过将 Martinez-Murcia 等人 [30] 鉴定的六个管家基因与参考序列进行匹配，获得了 A. caviae 物种的确凿证据。两种分离株在 gyrBandrecA 基因上与 A. caviae 菌株的身份匹配率为 100%，在 rpoD 和 gyrA 基因上的身份匹配率为 >99.6%，在 dnaJ 和 dnaX 基因上的身份匹配率为 >98.5%。两种 KCMC 分离株在多个基因上匹配不同的等
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