为重建可能的人类免疫缺陷病毒-1传播网络而开展的流行病学调查：病例报告
抽象的
最近发表的研究强调了系统发育和系统动力学分析在支持流行病学调查重建人类免疫缺陷病毒传播网络方面的重要性。在这里，我们报告了一例男性和女性之间通过性传播人类免疫缺陷病毒 1 型的病例，这再次表明了系统发育和流行病学之间加强合作的重要性。
我们描述了一对稳定的白人异性恋夫妇中人类免疫缺陷病毒 1 型亚型 B 传播的病例。当他们到罗马大学公共卫生和传染病系就诊时，男方 30 岁，女方 21 岁。这对夫妇报告有吸毒史。
系统发育分析是一种强大的技术，如果使用得当，可以在研究调查中发挥巨大作用。在本案例中，系统发育分析与流行病学证据使我们能够确定人类免疫缺陷病毒感染的最可能来源。根据系统发育，年代树使我们能够确定传播事件、时间点和传播方向，这与根据临床病史确定的推定感染时间一致。
背景
人类免疫缺陷病毒（HIV）的特点是遗传异质性大，这是由多种因素造成的，例如逆转录酶缺乏校对能力[1,2]、HIV-1 在体内的快速周转[3]、宿主的选择性免疫压力[4]，以及复制过程中的重组事件[5]。
大多数 HIV-1 毒株聚集在一个称为 M（代表 Main）的大组中，该组包括九个具有不同系统发育的亚型（A–D、F–H、J 和 K）。A 亚型和 F 亚型可进一步分为 A1–A4 亚型和 F1 和 F2 亚型。还观察到了许多亚型间重组病毒 [6–8]。
HIV-1 M 组亚型是全球大多数 HIV 感染的病因。在意大利，非 B 亚型感染的估计百分比据报道在 2.4% 至 19.4% 之间，从而证实了非 B 亚型感染率的显著增加 [9–15]，但在该国，艾滋病毒流行的第一阶段主要局限于静脉注射毒品使用者风险人群，HIV-1 B 亚型占绝对优势，就像其他西方国家一样 [16]。
系统发育学是分子生物学的一个分支，它推断有关物种分类和进化的知识 [17]。它是研究导致慢性感染的快速进化的 RNA 病毒的有力工具。本病例报告强调了系统发育分析对于支持重建传播网络的流行病学调查的重要性。
我们介绍了一个在稳定的同居异性恋夫妇中 HIV-1 亚型 B 传播的病例，以再次强调系统发育学和流行病学之间“紧密合作”的重要性。
病例介绍
我们描述了一个在稳定的白人异性恋夫妇中 HIV-1 亚型 B 传播的病例。在他们到罗马大学“Sapienza”公共卫生和传染病系就诊时，男子 30 岁，女子 21 岁。1996 年，14 岁的男子染上了注射毒品瘾，在吸毒 14 年后进入康复社区，在此期间，他从事针头交换活动。女子从 12 岁到 19 岁一直沉迷于注射毒品，并且还从事不安全的针头交换活动。他们在她加入他的康复社区后相识。
我们的流行病学调查分两个阶段进行。2013 年 4 月初，他因疑似感染丙型肝炎病毒 (HCV) 而引起我们的注意。他报告右半胸部最近出现了恶性带状疱疹。在体检过程中，我们发现有多处生殖器病变，提示是尖锐湿疣。根据他的流行病学史和这些临床发现，我们建议对患者进行 HIV 感染检测。结果发现，他的 HCV IgG 呈阳性（抗 HCV Advia Centaur 免疫分析系统，西门子医疗诊断公司，美国纽约州塔里敦），HCV RNA 呈阴性（Versant HCV RNA 1.0 检测（kPCR），西门子医疗诊断公司）。他是 HIV-Ag/Ab 阳性（Advia Centaur Systems HIV Ag/Ab 组合检测，西门子医疗诊断），HIV RNA 计数为 102,900 拷贝/毫升（Versant HIV 1.0 RNA 检测（kPCR），西门子医疗诊断），CD4+ T 细胞计数为 20 细胞/μL（1.55%）。基因型耐药性测试（Trugene HIV-1 基因分型检测，西门子医疗诊断）显示为野生型病毒。我们的患者开始接受替诺福韦、恩曲他滨、阿扎那韦和利托那韦联合抗逆转录病毒疗法 (cART)。基于这些发现，我们对患者的伴侣进行了 HIV 和 HCV 感染检测。她是 HIV-Ag/Ab 阴性、HCV IgG 阳性和 HCV RNA 阴性。
两周后，该名妇女因体温升高和全身皮疹来到市医院急诊室。血液检查结果显示白细胞计数为 1200 个细胞/毫升。她出院时被诊断为病毒感染，并被指示前往传染病诊所接受门诊治疗。
出院后的第二天，我们的患者来到我们的中心，报告她的月经推迟了两天。她的 β-人绒毛膜促性腺激素检测呈阳性。再次进行了 HIV-Ag/Ab 检测，结果仍为阴性，但我们还是对她进行了 HIV RNA 检测，结果为 4161 拷贝/毫升。根据美国卫生和公众服务部指南，考虑到 HIV-Ag/Ab 检测阴性时 HIV RNA 含量 <10,000 拷贝/毫升，我们使用来自同一患者的另一个样本重复了 HIV RNA 检测，发现 HIV RNA 计数为 1,302,000 拷贝/毫升。此时，HIV-Ag/Ab 检测结果为“未确定”，在确认性蛋白质印迹试验中出现单个 gp41 阳性带。cART 以替诺福韦、恩曲他滨和雷替拉韦开始。和她的伴侣的情况一样，基因型抗药性测试显示病毒为野生型。基因分型测试显示夫妻双方病毒趋向一致，CXCR4 趋向性与 geno2pheno 算法预测的一致，假阳性率为 10% [18]。5 月初，我们的患者因急性逆转录病毒综合征而自然流产。
为了支持流行病学调查，我们根据最近描述的系统发育统计框架，利用我们两名患者的 env 病毒序列，在日历时间范围内重建了传播网络 [19,20]。为了进行病毒学和系统发育分析，我们进行了外周血单核细胞分离和 DNA 提取，如前所述 [21]。通过嵌套聚合酶链反应扩增 env 区域，并使用以下引物进行测序反应：5′-CTGTTAAATGGCAGTCTAGC-3′、5′-GCAATGTATGCCCCTCCCATC-3′ 和 5′GCTCCATGTTTTTCCAGGTC-3′。使用 Sequencher 和 Bioedit 软件包进行序列分析。通过将两个序列分别上传到 REGA HIV-1 自动分型工具 v2.0 中来确定这两个序列的亚型 [22]。
我们建立了两个不同的数据集：一个包含男性和女性序列，另一个不包含女性序列，以确定男性感染情况。使用 CLUSTAL W 软件将核苷酸序列与已知来源和日期的 35 个参考 HIV-1 B 亚型序列（26 个来自意大利，6 个来自其他国家）进行比对，并使用 BioEdit 根据其密码子阅读框架进行手动编辑 [23,24]。这些参考序列是通过 Blast 相似性搜索获得的。
我们使用 PAUP* 4.0 软件 [23,24] 中实现的 ModelTest 3.7 进行了分层似然比检验，并确定进化模型为最佳拟合的核苷酸替换模型。
通过使用 BEAST 软件包版本 1.8 中实现的贝叶斯马尔可夫链蒙特卡罗 (MCMC) 方法同时推断进化率、种群和模型参数，获得了确定年代的系统发生学 [18,25]。通过计算每个单系分支的后验概率，获得了对特定分支的统计支持。使用 ModelTest 选择的 HKY +I+G 替代模型生成树。
在严格和宽松的时钟条件下，MCMC 运行了 50×106 代，直到根据有效采样大小 (ESS) 实现收敛。仅接受大于 250 的 ESS 值。作为合并先验，我们比较了三个参数模型（常数、指数、扩展增长）和一个贝叶斯天际线图非参数模型。
对于第一个数据集，选择了宽松（不相关对数正态）时钟下的扩张增长模型，而对于第二个数据集，选择了宽松（不相关对数正态）时钟下的指数增长模型。
REGA 亚型分析将这两个序列归类为 B 亚型。我们的患者分离株形成了一个显著的单系群（后验概率 = 1）（图 1a），显示出很强的关系，并确认感染了同一种病毒。
图 1
HIV-1 B 序列的贝叶斯时间标度树。分支上的星号 (*) 表示对该分支所属分支的显著统计支持（后验概率 = 100%）。内部节点的数字表示估计的起源日期和 95% 最高后验密度间隔表示的不确定性。a 夫妇（男性和女性）树。b 已确定日期的男性病毒系统发育
在雄性年代系统发育（图 1b）中，雄性序列与来自美国的序列相关，最近共同祖先的时间估计为 1998 年（95% 最高后验密度，1991 年至 2004 年）。
贝叶斯分析证实了传播网络，使我们能够以 99% 的概率确定传播事件的日期。此外，两名患者之间存在流行病学关系，证实了系统发育分析，并与根据临床病史推断的感染日期一致。贝叶斯分析还证实，我们的男性患者可能在开始使用非法药物约两年后，在与我们的女患者建立关系之前感染了病毒。
结论
HIV-1 和 HIV-2 传播网络已在医院内和非医院内感染中有所描述 [19,20,26]。2010 年，一篇关于医护人员因针刺伤而感染 HIV-1 的报告被报道并发表 [23]。近期病例报告分析和人群研究也证实了流行病学调查与系统发育分析之间的联系 [24,26]。全球范围内开展的前瞻性监测研究报告显示，HIV 传播风险为 0.09% 至 0.3% [27]。
使用贝叶斯方法对日历时间尺度内的传播网络进行系统动态重建，与流行病学数据一致，提供了有据可查的传播框架，从而显著改善了我们案例的调查。
系统发育分析是
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