儿童急性人类博卡病毒 1 感染，并出现危及生命的双侧细支气管炎和右侧肺炎：病例报告
抽象的
人类博卡病毒 1 是一种常见的人类细小病毒。许多研究表明，人类博卡病毒 1 是与儿童急性呼吸道感染有关的病原体。然而，由于人类博卡病毒 1 在急性感染后会在上呼吸道中持续存在很长时间，因此急性人类博卡病毒 1 感染的定义和诊断具有挑战性。到目前为止，仅检测人类博卡病毒 1、呼吸道样本中的高病毒载量和病毒血症与急性呼吸道疾病的临床表现有关。没有研究表明在外周血单核细胞中检测人类博卡病毒 1 信使核糖核酸是急性下呼吸道感染的诊断标志物。
我们报告了一名 17 个月大的拉脱维亚男孩的病例，该男孩因急性双侧细支气管炎入住重症监护室，入院前 6 天流鼻涕和咳嗽，最后 2 天发烧，随后出现严重呼吸窘迫和气管插管。人类博卡病毒 1 是通过定性多重聚合酶链反应检测组检测到的唯一呼吸道病毒。为了诊断急性人类博卡病毒 1 感染，我们同时使用了分子和血清学方法。通过定性和定量聚合酶链反应，在鼻咽抽吸物、粪便和血液以及相应的无细胞血浆中同时检测到人类博卡病毒 1 脱氧核糖核酸 (DNA)，结果显示鼻咽抽吸物和粪便中的 DNA 拷贝数很高。尽管病毒血症载量低，但在外周血单核细胞中发现了人类博卡病毒 1 信使核糖核酸。为检测人类博卡病毒 1 特异性抗体，我们采用了非竞争性免疫球蛋白 M 和竞争性免疫球蛋白 G 酶联免疫测定法。血浆对人类博卡病毒 1 特异性免疫球蛋白 M 和免疫球蛋白 G 抗体均呈阳性。
血浆中存在人类博卡病毒 1 基因组 DNA、外周血单核细胞中存在人类博卡病毒 1 信使核糖核酸以及人类博卡病毒 1 特异性免疫球蛋白 M 是急性人类博卡病毒 1 感染的标志，可能导致危及生命的急性细支气管炎。
背景
急性下呼吸道感染 (LRTI) 是全球婴幼儿发病率和死亡率较高的原因。儿童肺炎占 5 岁以下儿童死亡总数的 16%，社区内所有病例中 7-13% 的病例有生命危险并需要住院治疗。病毒是表现各异的急性 LRTI 的最常见病因。呼吸道合胞病毒 (RSV) 是幼儿肺炎最常见的病毒病因 [1,2]。
人博卡病毒 1 (HBoV1) 是细小病毒科中第二种人类致病病毒，于 2005 年在患有急性呼吸道感染 (ARTI) 的儿童鼻咽抽吸物 (NPA) 中被发现 [3]。此后，世界各地均有报道出现与 HBoV1 相关的 ARTI [4]。
一方面，有研究表明 HBoV1 是与 LRTI 相关的病原体，主要发生在 3 岁以下儿童中 [5,6,7,8,9,10]。另一方面，HBoV1 也被发现感染于无症状儿童 [11,12,13,14]。这些情况乍一看似乎相互矛盾；然而，研究表明 HBoV1 可在鼻咽部停留数周甚至数月，从而导致临床上错误的聚合酶链反应 (PCR) 诊断。此外，还报告了危及生命甚至致命的 HBoV1 感染 [15,16,17,18,19]。急性 HBoV1 呼吸道感染的定义和诊断具有挑战性。血液中 HBoV1 脱氧核糖核酸 (DNA)、信使核糖核酸 (mRNA) 检测、呼吸道样本中的病毒载量评估和血清学检查已被推荐作为诊断活动性 HBoV1 感染的标志物 [6,7,20,21]。据我们所知，目前尚无研究表明外周血单核细胞 (PBMC) 中的 HBoV1 mRNA 检测可作为急性 HBoV1 感染的诊断标志物。
在本研究中，我们报告了一名健康儿童的急性 HBoV1 感染，该儿童患有危及生命的急性双侧细支气管炎和右侧肺炎，并在无细胞血浆中检测到 HBoV1 特异性免疫球蛋白 (Ig) M 和 DNA 以及 PBMC 中的 HBoV1 mRNA。
病例报告
2015 年 1 月，一名 17 个月大的拉脱维亚男孩在发病第七天被送往拉脱维亚里加儿童临床大学医院。他有流鼻涕和咳嗽病史，已持续 6 天，入院前最后 2 天发烧（腋窝温度 39.0°C）。由于严重的呼吸窘迫，他立即从地区医院转入我们的重症监护室。
入院时，呼吸频率为 44 次/分钟（参考值 20-30），心率 146 次/分钟（参考值 80-130），氧饱和度 99%（面罩供氧流量为 5 升/分钟），腋窝温度 38.7°C。肺部听诊发现双侧喘息和捻发音，肋间和肋下严重萎缩。其他器官系统无病变。由于呼吸窘迫严重，进行了气管插管。
该儿童足月出生，是家中第七个孩子。他没有已知的基础疾病、既往住院史或严重急性疾病。他已根据国家免疫计划接受了全面免疫接种。
入院时，白细胞 (WBC) 计数为 30.6 × 103/μL，粒细胞 66.9%（绝对值 20.6 × 103/μL），血红蛋白 12.4 g/dL，血小板计数 321 × 103/μL。C 反应蛋白 (CRP) 为 5.09 mg/L。胸片显示右肺上叶浸润（图 1）。
图 1
患者住院第一天的胸片（前后位），显示右上侧肺炎
入院时，鼻咽拭子（NPS）通过直接免疫荧光法（IMAGEN™ OXOID，英国）检测出呼吸道合胞病毒、甲型和乙型流感病毒、1-3 型副流感病毒和腺病毒抗原呈阴性。细菌血培养呈阴性。收集了 NPA、血液和粪便样本进行 HBoV1 分子诊断和血清学检测。
用定性多重 PCR 检测 NPA（Seegene Respiratory Panel，韩国）对以下病毒呈阴性：甲型流感病毒和乙型流感病毒；呼吸道合胞病毒 A 型和 B 型；甲型流感病毒 H1、H1pdm09 和 H3 型；腺病毒；肠道病毒；副流感病毒 1-4 型；亚肺病毒；鼻病毒；以及冠状病毒 NL63、229E 和 OC43 型。然而，用定性多重 PCR 检测 NPA 对 HBoV1 呈阳性。用 NPA、全血和相应的无细胞血浆以及粪便样本进行 HBoV1NS1DNA 定性 PCR，如所述 [20]。含有 HBoV1 的质粒用作 PCR 中的阳性对照。所有这些样本均为 HBoV1 DNA 阳性。经定量PCR（qPCR）（人类博卡病毒基因组，标准试剂盒，Genesig，Primerdesign Ltd.，英国）复检，NPA和粪便中的拷贝数较高，NPA中为5.7 × 105/μg DNA，粪便中为1.4 × 108/μg DNA。血液中的病毒载量为21拷贝/μg DNA，但无细胞血浆中的病毒载量低于检测水平。
为了证明 HBoV1 感染正在持续进行，我们进行了 PBMCs 中的 HBoV1 转录。根据制造商的说明（美国赛默飞世尔科技公司），使用 TRI Reagent® 溶液从 PBMCs 中提取总核糖核酸 (RNA)。提取的 RNA 用分光光度法定量，并在 1% 琼脂糖凝胶中进行电泳分析。使用 DNase（TURBO DNA-free™ 试剂盒，美国赛默飞世尔科技公司）处理 RNA，然后使用 RevertAid™ 第一链 cDNA 合成试剂盒（美国赛默飞世尔科技公司）通过逆转录酶 (RT) 合成互补 DNA (cDNA)。通过 PCR 检测 β-actingene 序列以评估合成 cDNA 的质量（图 2）。
图 2
针对 β-act 基因序列进行聚合酶链式反应后，扩增产物在 1% 琼脂糖凝胶中进行电泳可视化
2006 年，Slootset 等人利用 PCR 检测 HBoV1NS1 基因，检测 HBoV1 特异性 cDNA，随后在 1.7% 琼脂糖凝胶中对扩增产物进行电泳显影（图 3）[22]。用相同的 DNase 处理过的 RNA 样本（但没有进行 RT 步骤）作为 β-珠蛋白和 HBoV1 PCR 的阴性对照，以确保没有 DNA 污染。
图 3
针对人博卡病毒 1NS1 基因进行聚合酶链式反应后，在 1.7% 琼脂糖凝胶中对扩增产物进行电泳可视化。图例 1：1. pUC19 DNA/MspI (HpaII) 标记；2. 阴性对照（分子生物学级 H2O）；3. 由 DNase 处理的核糖核酸合成的互补 DNA 样品；4. 未经逆转录酶步骤的 DNase 处理的核糖核酸样品。图例 2：1. pUC19 DNA/MspI (HpaII) 标记；2. 未经逆转录酶步骤的 DNase 处理的核糖核酸样品；3. 由 DNase 处理的核糖核酸合成的互补 DNA 样品；4. 阴性对照（分子生物学级 H2O）；5.、6. 阳性对照（人博卡病毒 1 质粒）；7. GeneRuler 100 bp DNA Ladder
重组主要衣壳蛋白 VP3 的生物素化病毒样颗粒 (VLP) 被用作酶联免疫吸附试验 (EIAs) 中的抗原，用于检测患者血浆样本中的 HBoV1 特异性免疫球蛋白 M (IgM) 和免疫球蛋白 G (IgG) [23,24]。为了去除可能发生交叉反应的异源性人类博卡病毒 2 (HBoV2) 和人类博卡病毒 3 (HBoV3) IgG，在竞争试验中使用了非生物素化的 VLP，如所述 [24]。患者血浆样本对 HBoV1 特异性 IgM 和 IgG 抗体均呈阳性。
由于右肺上叶浸润和初期白细胞增多，该儿童接受头孢曲松 350 mg 静脉注射，每天两次，共 7 天，并口服奥司他韦 30 mg，每天两次（由于是流感季节）。由于流感病毒 A 和 B 抗原检测结果为阴性，3 天后停用奥司他韦。第 3 天拔管后，我们的患者被送往儿科，继续静脉注射头孢曲松，开始通过雾化器吸入沙丁胺醇和布地奈德，并开始肺部康复。在接下来的 10 天里，孩子的一般状况有所改善，体温正常，肺部声音没有病变，不需要额外的氧气。住院期间，我们的患者体重增长缓慢；因此，进行了额外的诊断检查并增加了住院时间。住院第 17 天，他又开始发烧 2 天。第二次 NPS 检测呼吸道合胞病毒、甲型流感病毒和乙型流感病毒均为阴性；但怀疑为自限性病毒性上呼吸道感染，这 2 天他接受了静脉补液和 70 毫克布洛芬治疗。由于家庭社会经济地位极低，尽管他的总体状况良好，但他仍住院主要进行观察。第 30 天，他又开始发烧、咳嗽和喘息，持续 6 天。在这次发作中，根据临床症状诊断为下呼吸道感染，并接受了雾化沙丁胺醇和布地奈德治疗。
住院 46 天后，他从 HBoV1 相关急性双侧细支气管炎、右侧肺炎以及随后的医院内获得性上呼吸道和下呼吸道感染中完全康复并出院。
讨论
HBoV1 常见于住院儿童的呼吸道样本中，高峰年龄为 24 个月 [24,25,26]。通过 PCR 检测，在出现急性细支气管炎和喘息的幼儿中，它是仅次于呼吸道合胞病毒和鼻病毒的第三大常见病原体 [4,27,28]。此外，血清学研究表明，HBoV1 急性感染最常发生在儿童早期，HBoV1 IgG 血清转化的中位年龄为 1.9 岁，到 6 岁时血清阳性率达到 80% [24]。一些临床病例显示，儿童因 HBoV1 感染而出现严重甚至危及生命的呼吸道疾病 [10,15,16,17,18,19,29]。然而，应该记住的是，由于 HBoV1 长期存在于上呼吸道，该病毒经常与其他呼吸道病原体同时检测到。因此，诊断不应仅基于呼吸道样本中 HBoV1 DNA 的定性 PCR [6,20,30]。血液中的 HBoV1 DNA 检测、mRNA 检测、呼吸道样本中的病毒载量评估和血清学检测已被推荐为更好的诊断工具，以区分活动性 HBoV1 感染和无症状病毒脱落 [6,7,20,21]。
在本报告中，我们介绍了一个 17 个月大的男孩的病例，他有典型的急性双侧细支气管炎症状：最初流鼻涕和咳嗽，随后呼吸困难，听诊有典型表现，包括喘息和捻发音。住院前 2 天发烧，白细胞高，绝对粒细胞增多。由于后期的发现表明有并发症，因此进行了胸部 X 光检查并确诊为右侧肺炎。临床病程的开始和正常范围的 CRP 值与病毒性下呼吸道感染相符。
多重 PCR 检测 NPA 仅对 HBoV1 DNA 呈阳性，而其他 18 种呼吸道病毒（包括经常导致该年龄组严重细支气管炎的病毒，RSV、鼻病毒和人类偏肺病毒）呈阴性。PCR 同时在粪便等所有样本中发现 HBoV1 DNA 并不奇怪。有人提出，ARTI 患者吞咽呼吸道分泌物会导致病毒通过胃肠道 [9]。通过 qPCR，在 NPA 和粪便中检测到高病毒载量。仅检测到 HBoV1、呼吸道样本中 HBoV1 DNA 载量高和病毒血症与急性 LRTI 的临床表现有关 [6,7]。然而，在其他一些情况下，病毒 DNA 可以在血液中长时间检测到 [15,16]。在我们的患者中，HBoV1 PCR 在无细胞血浆中也呈阳性，表明病毒已从细胞中释放出来，并且他患有 HBoV1 病毒血症。急性 H

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