信使 RNA 疫苗加强剂后免疫球蛋白 G 抗体水平呈指数下降、天花板效应、下调和 T 细胞反应：病例报告
抽象的
疫苗对严重急性呼吸综合征冠状病毒 2 感染的保护作用会随着时间的推移逐渐减弱，需要注射更新的加强剂。然而，对信使 RNA 疫苗第六剂后的长期免疫反应尚未进行充分研究。
我们对一名 69 岁日本男性的抗刺突蛋白免疫球蛋白 G 抗体水平进行了 76 次（第一剂至第六剂）纵向测定，以研究其动态。对于信使 RNA BNT162b2 疫苗，第一剂至第四剂是相同的单价疫苗，第五剂和第六剂是相同的双价疫苗。使用 T-SPOT 研究了第四剂和第五剂后的 T 细胞反应。免疫球蛋白 G 水平在第二剂至第六剂后的 1-2 周达到峰值，之后每次接种后呈指数下降。使用公式 f (t)=Ae−t/τ+C 近似计算下降幅度。时间常数τ随着每次加强免疫而增加，表明抗体滴度衰减的速度随着剂量的增加而降低。第二剂和第三剂的基线和峰值免疫球蛋白 G 水平相似。相反，第四剂后的基线免疫球蛋白 G 水平比第二剂和第三剂增加了五倍以上；第四剂后免疫球蛋白G峰值水平下降至第三剂后的60%。第六剂后基线免疫球蛋白G水平比第五剂高1.4倍；然而，第六剂后免疫球蛋白G峰值水平下降至第五剂后的56%。T细胞反应的动态与免疫球蛋白G抗体的动态不同。T细胞反应逐渐增加；然而，它们的峰值水平很难确定。
在信使 RNA 加强疫苗接种后，可以清楚地观察到免疫球蛋白 G 峰值水平的上限效应或下调。达到峰值后，IgG 水平呈指数下降，并且衰减率随着每次后续加强而降低。虽然这是一项单例研究，但这些数据可能为健康老年人的体液免疫提供一个通用的数学衰减模型。此外，我们的研究为信使 RNA 疫苗加强疫苗接种后的免疫原性提供了见解。
背景
截至 2024 年 3 月，导致 2019 年冠状病毒病 (COVID-19) 大流行的严重急性呼吸综合征冠状病毒 2 (SARS-CoV-2) 感染已影响全球超过 8 亿人，导致 800 万人死亡 [1]。信使 RNA (mRNA) 疫苗 BNT162b2 (辉瑞-BioNTech) 的有效性最初在一项随机对照研究中得到证实 [2]，从而引发了全球疫苗接种运动。此外，为应对大流行，疫苗和加强剂量已迅速开发，降低了传染性、疾病严重程度和总体死亡率 [3]。疫苗对 SARS-CoV-2 感染的保护作用会随着时间的推移逐渐降低，需要注射更新的加强剂。在大多数情况下，SARS-CoV-2 感染会导致自限性症状；然而，有潜在心脏病或肺病、糖尿病、免疫抑制和老年人等风险因素的患者可能需要住院治疗并发展为严重形式的疾病 [4]。老年人群的免疫衰老会降低疫苗的免疫原性和有效性，因为 S 蛋白特异性免疫球蛋白 G (IgG) 滴度显著降低，并且 S 蛋白特异性 CD4 和 CD8 T 细胞免疫在最初接种 BNT162b2 的个体中受到限制 [5]。免疫衰老尚不完全清楚，在后 Omicron 时代，为老年人群制定加强疫苗接种策略至关重要。
在 SARS-CoV-2 结构蛋白中，刺突蛋白和核衣壳蛋白是主要免疫原。评估针对刺突受体结合域 (RBD) IgG 的抗体对于获得针对 SARS-CoV-2 感染的保护非常重要，因为它具有中和活性 [6]。mRNA 疫苗产生的抗体专门针对 SARS-CoV-2 刺突蛋白 S1 亚基中的 RBD [7]。在 mRNA 疫苗诱导的免疫反应中，免疫记忆细胞的数量、功能和寿命至关重要 [8]。正在研究针对 SARS-CoV-2 S 蛋白 (RBD) 的 IgG 抗体水平，以评估接种疫苗后的体液免疫反应。已经提出了各种模型来描述 IgG 抗体的衰减模式，包括线性回归单相衰减模型 [8]、贝叶斯线性混合模型 [9] 和指数模型 [10]。然而，分析第六剂之前的长期动态的数学模型尚未建立。研究报告称，加强接种后抗体反应出现平台期或天花板效应 [11,12]。因此，进一步研究加强接种后的抗体反应动态可能为未来的疫苗接种策略提供参考 [6,11]。
在本研究中，我们对老年男性中从接种第一剂 BNT162b2 疫苗前到接种第六剂后 5 个月（跨越 2.5 年）的 IgG 抗体动态进行了详细的纵向分析。在第四剂和第五剂后，将作为体液免疫反应的 IgG 抗体水平与作为细胞免疫反应的 T 细胞反应进行了比较（T-SPOT®COVID，Oxford Immunotec Ltd.）。这项研究简单而独特，据我们所知，在文献中没有发现类似的报道。
病例介绍
研究对象为一名 69 岁的日本男性，除高血压外无潜在疾病，无吸烟史，体重指数为 21。BNT162b2 疫苗首剂接种于 2021 年 4 月 23 日，第二剂接种于 2021 年 5 月 14 日（首剂后 21 天），第三剂接种于 2021 年 12 月 25 日（第二剂后 216 天），第四剂接种于 2022 年 7 月 29 日（第三剂后 227 天），第五剂接种于 2022 年 12 月 24 日（第四剂后 147 天），第六剂接种于 2023 年 6 月 19 日（第五剂后 140 天）。六剂均为 BNT162b2 疫苗。第一至第四剂为相同的单价疫苗（野生型 [WT]），而第五和第六剂为相同的双价疫苗（含 Omicron BA.4 和 BA5）。所有剂量均为 0.3 cc。在整个观察过程中，参与者没有感染 COVID-19，这通过三次阴性抗核衣壳抗体检测和 IgG 抗体动态监测得到证实。
使用 Architect SARS-CoV-2 IgG II Quant 检测法（Abbott，美国）评估抗体水平 [13,14]，定量测量血清抗刺突蛋白 IgG 抗体水平。根据研究设计定期采集血液样本。抗体测量由一家商业实验室（BML Inc.，日本）进行。该检测法的截止水平为 50 AU/mL。
定期测量 IgG 抗体水平，从第一次 BNT162b2 剂量前确认阴性结果之日起、第一次剂量后 2 周、第二次剂量时开始，每隔 1 周测量一次，直到第二次剂量后 1 个月。随后，在第三次剂量时测量，每周测量一次，直到第三次剂量后 1 个月，此后大约每 2 周测量一次。第四次剂量后，第一个月每周测量两次，此后大约每 2 周测量一次。第五次和第六次剂量后的测量间隔为第一个月每周一次，此后每 2-4 周一次。总共进行了 76 次测试，测试之间的中位间隔为 13 天（四分位距 [IQR]：7-14 天）（补充表 1）。
接种疫苗后 IgG 抗体水平的波动通过近似方程 f(t) =Ae−t/τ+C 测量，其中 τ 是时间常数；检查每种抗体反应的特征。我们还使用指数函数确定了峰值抗体水平下降一半所需的时间 (tmax/2)。
我们使用 T-SPOT® COVID 试剂盒（英国 Oxford Immunotec）[15] 研究了第四剂后长达 8 个月的 T 细胞反应；样本外包给商业实验室（日本 LSI Medience Corporation）。同一天同时分析 T 细胞反应和 IgG 抗体水平。第四剂和第五剂后的第一个月每周两次间隔测试，接下来的一个月每周一次，此后每两周一次。总共进行了 24 次测试，中位测试间隔为 7 天（IQR：4-14 天）。
T-SPOT® COVID 检测基于标准化酶联免疫斑点 (ELISPOT) 技术，可检测对 SARS-CoV-2 有反应的 T 细胞 [16]。接种疫苗后，幼稚 T 细胞分化为 SARS-CoV-2 特异性 T 细胞 (CD4/CD8)。含有这些特异性 T 细胞的外周血单核细胞 (PBMC) 被用作样本。采血后，从血液中分离 PBMC 并清洗，确定细胞计数并调整为常数。然后使用酶联免疫吸附测定板将 PBMC 与源自 SARS-CoV-2 的病毒肽一起培养，并刺激 T 细胞释放的细胞因子 (IFN-γ)。然后从板中取出细胞，加入碱性磷酸酶标记的抗体和底物。标记的抗体已经与 IFN-γ 结合，并且斑点可视化。每个点代表一个 T 细胞，并计数对特定抗原作出反应的斑点形成细胞 (SFC) 的数量；截止水平为八个点。使用自动 ELISPOT 平板读数仪进行测量并进行手动验证。
图 1 显示了疫苗接种第一剂后 2 周至第六剂后 5 个月的抗刺突蛋白 (RBD) IgG 抗体水平动态。第一剂后 2 周抗体水平略呈阳性，为 71 AU/mL。虽然第二剂和第三剂时的抗体水平相似，分别为 197 AU/mL 和 184 AU/mL，但第四剂时的抗体水平为 1094 AU/mL，是第二剂或第三剂的 5 倍。抗体水平在第二剂和第五剂后 7 天达到峰值，在第三剂、第四剂和第六剂后 14 天达到峰值。峰值抗体水平在第二剂后略微增加至 7831 AU/mL，在第三剂后增加至 8897 AU/mL。第四剂后的抗体水平下降至 5469 AU/mL，比第三剂后低 60%。第五、六剂为双价疫苗，与第五剂后的抗体峰值11000 AU/mL相比，第六剂后抗体峰值为6209 AU/mL，下降了56%，抗体水平在达到峰值后呈现指数下降趋势。
图 1
病例参与者的 IgG 抗体水平动态。从第一剂到第四剂后 5 个月，这名 69 岁男子体内的抗体水平一直保持稳定。抗体水平在 1-2 周后达到峰值，随后呈指数下降
每次接种后的抗体滴度使用以下近似公式计算：y=Aexponential (exp)(−t/τ) +C，其中τ表示时间常数。
第二次接种后：y= 7.1 × 103exp (−t/2.3 × 10) + 4.1 × 10.2
第三次接种后：y= 7.9 × 103exp (−t/6.4 × 10) + 8.4 × 102
第四次接种后：y= 5.3 × 103exp (−t/1.1 × 102) + 1.7 × 102
第五次接种后：y= 1.0 × 104exp (−t/6.3 × 10) + 1.0 × 103
第六次接种后：y= 6.3 × 103exp (−t/1.5 × 102) + 0.0
表 1 列出了每次疫苗接种的参数。时间常数τ随每次剂量增加。
图2显示了第二剂至第六剂后IgG抗体水平从峰值开始的动态变化以及基于近似公式的衰减曲线。单价和双价疫苗的衰减率随着后续每剂加强剂量而降低。
图 2
第二、三、四次接种疫苗的天数和 IgG 峰值水平的变化。每剂疫苗后的抗体水平以衰减曲线表示，基于以下近似公式：y=Aexp(−t/τ) +C，时间常数为τ。衰减率随着每次后续加强剂量而降低
使用 T-SPOT®COVID 试剂盒检测的 SFC 显示，第四剂接种时的基线水平为 42 个斑点。尽管 IgG 抗体水平在第四剂接种后 14 天达到峰值，但 SFC 水平在第四剂接种后约 1 个月达到温和峰值；然而，很难确定第五剂接种后的峰值 SFC 水平（图 3）。SFC 水平的偏差大于 IgG 抗体水平的偏差。
图 3
第四剂后 IgG 抗体水平 (AU/mL) 和 T-SPOT (SFCs)。在研究期间，T-SPOT 试剂短缺导致测试间隔为 42 天。T 细胞反应的动态与 IgG 抗体不同。SFCs，斑点形成细胞
讨论和结论
在基于 IgG 抗体水平的体液免疫研究中，接种后测量抗体水平的时机至关重要。接种后初始抗体滴度取决于从接种到检测的时间，并在加强剂量后 1-2 周达到峰值 [17]。接种后 1 个月，IgG 抗体水平下降至 1 周时水平的 43%，3 个月后进一步下降至 1 周时水平的 11% [13]。与单价疫苗后的 IgG 抗体研究相比，二价疫苗的研究很少。最近的报道表明，WT 和 WT+Omicron BA.1 组第二次加强剂量后的 IgG 抗体水平相似 [18]。mRNA 疫苗接种后的 IgG 滴度衰减模型尚未完全建立。在这种情况下，第二至第六次剂量后的 IgG 抗体水平在 1-2 周后达到峰值，随后呈指数下降。虽然已经提出了几种有关 IgG 抗体衰减的数学模型 [8,9,10]，但它们是基于接种疫苗后 3-4 次测量的 IgG 抗体水平。因此，很难建立 IgG 抗体长期动态的数学模型。此例可能是第一份证明指数衰减的报告，本研究获得的数据可作为数学模型。
很少有研究评估第四剂后的 IgG 抗体峰值水平 [19]。在本病例中，第二剂和第三剂疫苗接种后的基线抗体水平和峰值抗体水平相似，这表明第三剂疫苗对峰值抗体水平的加强作用被抑制。
一些研究表明，与第三剂相比，第四剂并没有增强体液和细胞介导免疫，尤其是在基线抗体水平高的情况下，这表明存在天花板效应 [11,20]。有趣的是，我们的研究表明，第四剂时的基线抗体水平比第三剂增加了 5 倍，第四剂后的峰值抗体水平降至第三剂后的 60%。第四剂后可能出现了下调。此外，我们的研究还表明，在第六次接种二价疫苗加强剂后也观察到了类似的下调。与我们的研究结果一致，最近的报告显示加强剂后的衰减动力学较慢，并且对每次加强剂后获得的整体峰值抗体滴度存在天花板效应 [21]。
最近有研究表明，限制记忆 B 细胞 (MBC) 的再激活会抑制加强剂量后的抗体水平 [20]。mRNA 疫苗加强接种后抗体水平减弱的生化和分子生物学机制尚不完全清楚。
IgG 抗体水平在加强剂量后 1-2 周达到峰值 [17]，主要是由于 EF 反应中 MBC 和短寿命浆细胞 (SLPC) 的激活。EF 反应中产生的 MBC 分布不均一，可诱导长期免疫。这些 MBC 迅速分化为浆母细胞和抗体分泌细胞 (ASC)，通过强效且多样的低亲和力次级反应导致初始爆发 [22,23]。外周 B 细胞和 SLPC 的凋亡发生在早期，导致抗体水平下降。EF 反应中产生的 MBC 与负责生发中心 (GC) 反应中细胞间相互作用的 MBC 形成不同的簇 [24]。SARS-CoV-2 感染后的过度 EF 反应会释放大量与疾病严重程度相关的抗体和炎性细胞因子 [25]。在严重的情况下，细胞因子风暴过度表达肿瘤坏死因子-α会抑制 GC 形成并抑制 T 滤泡辅助细胞 (Tfh) 分化 [26]。抑制 SARS-CoV-2 感染中的过度抗体反应非常重要，最近的研究表明，线粒体在感染期间调节 EF B 细胞反应 [26]。细胞内钙离子也通过抑制线粒体功能来调节 B 细胞反应 [27]。在这项研究中，峰值抗体水平被加强疫苗接种抑制，表明存在调节 EF 早期 B 细胞反应的机制。
在 EF 反应之后，B 细胞在 GC 反应中与抗原相互作用，并被抗原特异性 CD4+Tfh 激活。经过抗原特异性选择的激活 B 细胞反复增殖和分化，产生高亲和力抗体 [22]。一些 GC B 细胞以 MBC 的形式进入静止状态，并被认为作为终末分化、长寿的浆细胞在骨髓中存活很长时间，产生大多数血清抗体 [28]。最近的一项研究表明，加强疫苗接种 3 周后 MBC 有所增加 [29]，这可能与本研究中每次加强疫苗接种后抗体衰减率降低有关。这表明加强疫苗接种后免疫记忆得到增强。
已有研究报道了感染或接种 SARS-CoV-2 后的细胞介导免疫。此外，许多研究已经使用 T-SPOT® COVID 研究了 T 细胞反应，但没有一项研究像本研究一样通过频繁测试纵向评估这些反应。加强疫苗接种后 IgG 抗体的增加在 6 个月内迅速下降，而 MBC 和 T 细胞反应在第二次接种疫苗 8 个月后仍然可以检测到 [30]。关于接种疫苗后 T 细胞反应与体液免疫之间相关性的报道各不相同，有些显示出弱相关性 [31]、中等相关性 [32]、无相关性 [33]，甚至反相关 [34]，其潜在机制尚不完全清楚。有趣的是，在我们的病例中，IgG 抗体水平在第四剂后 14 天达到峰值，而 T 细胞反应较弱且与抗体水平不成比例。第四剂后的 T 细胞反应出现轻微峰值，但第五剂后很难检测到。在这种情况下，在第四剂和第五剂后观察到的弱 T 细胞反应表明细胞免疫可能存在天花板效应 [35]、个体差异 [36] 或免疫衰老 [36]。一项研究表明，尽管 B 细胞内在变化会随着年龄的增长而延迟老年人的 GC 反应，但它们并不影响向 ASC 的分化或其增殖 [37]。在老年人中，刺突特异性 CD4 + T 细胞通过表达高水平的程序性细胞死亡-1 来抑制细胞介导的免疫反应，从而抑制刺突特异性 CD8 + T 细胞的诱导 [36]。此外，有研究表明，老年人群中调节性 T 细胞 (Tregs) 的活性会增加，并且可能通过抗原刺激进一步增强 [38]。此外，疫苗效力随年龄增长而下降被认为是由于 Treg 活性增加所致 [39]。最近，膜结合 CD83 被认为是 Treg 稳态和稳定性的重要因素 [40]。 SFC 水平与 IgG 抗体水平相比存在很大偏差 [41]，使用 T-SPOT® COVID 进行 T 细胞反应研究应考虑这种偏差。因此，这项研究可能代表了加强疫苗接种后老年人群中最常见的 T 细胞免疫反应。
在后奥密克戎时代，SARS-CoV-2 再感染已变得很常见，日本夏季和冬季都发生疫情，老年人口患各种心脏、肺部和神经系统并发症的风险很大。一项关于 COVID-19 疫苗的系统评价分析了 9 项和 21 项研究的数据，发现其有效性和免疫原性在 55 岁及以上的人群中得到观察。保护效果的主要决定因素是主要疫苗的选择（mRNA 疫苗更有效）和加强剂量的数量 [42]。同样，最近对 22 项针对 60 岁及以上成年人的随机对照试验的荟萃分析显示，COVID-19 疫苗可有效预防感染并降低老年人的总体死亡率，但并未有效降低住院率或重症监护病房入院率 [43]。这些研究表明，COVID-19 的主要疫苗周期不足以为老年人提供针对 COVID-19 的保护，需要加强注射策略来增强和延长免疫反应。制定策略时应考虑导致老年人群疫苗免疫原性的因素，例如剂量、加强剂量间隔、添加适当佐剂以诱导免疫刺激[44]，以及同源和异源疫苗之间的选择。
关于疫苗剂量，接种较低剂量的 mRNA-1273 疫苗（50 µg 对比标准剂量 100 µg）后观察到 IgG 亲和力增加 [45]。该研究报告了一种反剂量反应关系，低剂量的 mRNA-1273 足以诱导非劣效免疫力。相反，较高剂量的 Ad26.COV2.S 诱导的体液反应比较低剂量的免疫原性更强，表明存在剂量反应关系 [46]。这些研究是在早期加强疫苗接种期间进行的，在 Omicron 变种猖獗期间进行的研究很少；因此，需要进一步研究。
在以 6 个月、9 个月和 12 个月为间隔的 mRNA 疫苗加强免疫中，较短间隔的加强免疫可显著降低 COVID-19 感染的累积频率以及住院或死亡风险。加强免疫对≥65 岁的人群比对 <65 岁的人群更有效 [47]。关于加强免疫间隔的类似研究表明，84 天比 56 天更有效 [46]，84 天比 28 天更有效 [45]。这些研究表明，早期加强免疫间隔约 3-6 个月是有效的；然而，由于在 Omicron 时代没有进行过类似的研究，因此尚未确定优化免疫原性的免疫间隔。在日本，直到 2023 年，疫苗接种几乎每年接种两次，但从 2024 年开始将每年接种一次。
使用异源 COVID-19 初免-加强疫苗接种方案可能有助于大规模接种 COVID-19 疫苗。然而，与参考方案相比，异源 BNT162b2 + mRNA-1273 疫苗接种方案产生的免疫反应并不逊色 [45]。关于腺病毒载体疫苗和 mRNA 疫苗的异源方案的免疫原性，已证实 ChAdOx1 nCoV-19 和 BNT162b2 的异源和同源方案可以在 4 周的初免-加强间隔内诱导类似的免疫反应 [48]。
在 COVID-19 大流行的 5 年中，大量人群是自然感染的。在一项关于先前感染 SARS-CoV-2 对使用二价 BA.4/5 适应性 mRNA 疫苗加强接种后免疫力的影响的观察性研究中，先前感染的个体具有更高的疫苗诱导抗刺突 IgG 抗体和中和滴度；然而，未感染个体的相对增幅明显更高 [49]。这表明老年人群的加强疫苗接种策略应考虑先前的感染状况。
在我们的研究中，IgG 水平在第二至第六剂接种后 1-2 周达到峰值，随后随着每剂接种呈指数下降，使用以下方程可近似计算：f(t) =Ae −t/τ+C。如果确定了可以预防 COVID-19 的阈值，那么老年人群的最佳加强间隔可能在数学上适用。
本研究的局限性包括其单一参与者性质以及缺乏对 MBC 的调查。此外，仅在第四剂和第五剂后才有 T 细胞反应的数据。加强疫苗接种的有效性取决于疫苗类型的选择、最佳疫苗剂量、接种时间和抗体反应的衰减动力学。因此，需要进一步研究以探索早期体液免疫反应、每次加强疫苗接种对免疫记忆的改变以及体液和细胞免疫反应之间相互作用的机制。
总之，我们报告了一位老年患者在接种 mRNA 疫苗第六剂之前详细的长期免疫反应。在接种 mRNA 加强疫苗后，可以清楚地观察到 IgG 峰值水平的上限效应或下调。在达到 IgG 峰值后，每次加强疫苗接种后都会出现指数下降。此外，在接种单价和二价加强疫

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