因昼夜节律和疾病导致的人体 25-羟基维生素 D 变化：病例报告
抽象的
维生素 D 营养研究需要精确测量循环中的 25-羟基维生素 D。我们的目标是测试是否可以在单个体中统计地证明血点 25-羟基维生素 D 浓度的昼夜波动，以及这种波动是否受到服药前与服药后抽血时间的影响。
本案例研究的参与者是一名 40 多岁、身体健康的白人女性，已在中午服用 5000 IU 维生素 D3 补充剂超过 1 年。每 4 天，分别在早上、中午或晚上通过手指刺破采集血液样本到滤纸上（每个采集日采集 3 组，每组 5 个血液样本）。第 1 天和第 2 天，中午样本是在服用补充剂后约 1 小时采集的；第 3 天和第 4 天，中午样本是在服用补充剂前 1 小时内采集的（这是药物的经典每日“谷值”）。25-羟基维生素 D 浓度存在明显的每日变化模式（4 天中的 3 天的方差分析 p ≤ 0.02）：中午平均 25-羟基维生素 D 的峰值比早上高约 20%，比晚上高约 13%。与服药后一小时取样相比，谷底取样对 25-羟基维生素 D 的影响没有显著差异。一个偶然的发现是，研究期间的急性病与一天中每个取样时间的 25-羟基维生素 D 急剧降低有关（p<0.00001）。
25-羟基维生素 D 的昼夜变化一致，峰值出现在中午。谷值和服药后抽血之间没有差异。急性病可能会急剧降低血清 25-羟基维生素 D 水平。由于人与人之间、日内 25-羟基维生素 D 的变异性约为 20%，因此取样时间会在维生素 D 营养评估中引入系统误差，这种误差比随机分析误差或测定方法的选择更大。
背景
由于皮肤在暴露于 UVB 波段的紫外线 (UV) 光时会产生维生素 D，因此，血清 25-羟基维生素 D [25(OH)D] 浓度（维生素 D 营养状况的衡量标准）在温带地区人群中呈现季节性节律是合乎逻辑的 [1]。血清 25(OH)D 水平具有较长的半衰期，并由储存在肌肉和脂肪组织中的维生素 D 和 25(OH)D 维持 [2]。由于血清 25(OH)D 具有较长的表观循环半衰期，因此人们长期以来推测抽样的时间并不重要。在单独服用大剂量维生素 D 后，血清 25(OH)D 会在几天内升高，并维持数月 [2,3]。但是，如果持续每日服用维生素 D，血清 25(OH)D 需要数月才能达到稳定水平 [4]，而且我们还不知道有任何研究调查过每次服用后数小时内血清 25(OH)D 是否会发生波动。
检测方法已受到广泛关注，旨在标准化维生素 D 营养状况评估 [5,6]。值得注意的是，似乎没有一位 25(OH)D 检测专家考虑到参与者内部 25(OH)D 测量的差异性。最近的报告令人信服地表明，对于不同的人群，血清 25(OH)D 存在明显的昼夜节律 [7,8]。尽管 70 岁以下成年人的维生素 D 推荐膳食摄入量 (RDA) 为 600 IU/天 [9]，但内分泌学会的建议摄入量为 2000 IU/天 [10]，而且许多美国人选择摄入更高的维生素 D 日剂量。这些情况促使我们探讨是否有可能检测到单个体血清 25(OH)D 的日内波动，以及这些波动是否可以归因于持续的每日生理量维生素 D 摄入周期，即 5000 IU/天 [1,11]。
病例介绍
该研究由 GrassrootsHealth 队列的一名参与者进行，这是一项大型前瞻性队列研究，其中志愿者提交家庭血斑 25(OH)D 测试套件并完成在线健康问卷。案例研究参与者是一名 40 多岁、身体健康的白人女性，居住在美国南加州北纬 34 度。该个体于 2008 年 12 月参加 GrassrootsHealth 研究，其 25(OH)D 测量值曾超过 60 ng/ml（将值转换为 nmol/L，乘以 2.5）。在本研究第一天之前的一年多时间里，她每天中午服用 5000 IU 的维生素 D 补充剂。没有定期服用其他补充剂。GrassrootsHealth 研究已获西部机构审查委员会 (美国华盛顿州奥林匹亚) 批准，提交结果的个人签署了使用数据的同意书。
本研究中，血斑 25(OH)D 浓度的测量由 ZRT 实验室（美国俄勒冈州比弗顿）使用液相色谱-质谱法 (LC-MS/MS) 分析干血斑检测试剂盒来确定。25(OH)D 结果经过校准，以匹配基于血清的检测方法获得的数值，并且 ZRT 检测已根据维生素 D 外部质量评估计划 (DEQAS) LC-MS/MS 共识组进行了验证（R2 值为 0.998）。使用 LC-MS/MS 分析干血斑卡中的 25(OH)D 已根据放射免疫分析法进行了验证（R2= 0.91，斜率与 1.0 相同）[12]。
测定方法的不精确性，平均 25(OH)D 为 50.7 ng/ml（与本文报告水平最接近的质量控制值），变异系数为 7.7% [13]。为了解释分析变异性，并有足够能力检测出一天内或一周内 25(OH)D 的 5% 波动，测试参与者每隔 8 小时提供 5 组独立抽取的样本，在四个测试日中，每天共提供 15 个样本。
第一组两天的测试，即采样日 1 和 2，在 2017 年 10 月中旬相隔 7 天。在此期间，我们的参与者继续保持正常饮食、锻炼、睡眠和补充习惯。除了补充之外，她的正常饮食中几乎不含维生素 D，偶尔（平均每周不到一次）吃鱼，并少量食用乳制品（主要是奶酪）。典型的日照集中在早晨，户外运动（跑步或散步）和 09:00 之前进行轻度园艺活动。
第二组两天的测试，即第 3 天和第 4 天，在 2017 年 11 月中下旬相隔 13 天。对于这两个收集日，获得了理论上的“谷值”，因为中午的样本是在每日剂量之前采集的。我们的参与者报告说，在第 3 天最后一次样本采集后 24 小时开始感冒。补充程序没有变化，但饮食、运动和睡眠都进行了调整以适应感冒症状。第 4 天的收集日从原定的 1 周随访推迟到感冒消退后，即第 3 天收集日期后的 13 天。
使用 R 软件 (www.r-project.org) 进行统计分析，并使用 SPSS 2017 版进行确认。虽然血样是从同一个人身上重复采样的，但统计分析将每个单独采集的样本视为一个单独的值，而不是与其他值配对。在每个时间点，采集五个单独的血样以生成一组值。这种方法用于解决在同一个体中，在一天中的不同时间采集的平均血液 25(OH)D 值是否存在显著差异的问题。样本根据采集时间和相对于剂量的采血时间分组（第 1 天和第 2 天，在服药后一小时采血，第 3 天和第 4 天，在药物的理论“低谷”时间，即服药前一小时内采血）。每天的比较都通过单因素方差分析 (ANOVA) 进行，然后对各个样本组进行 Bonferroni 校正比较，因为我们要调查在早上、中午和晚上从同一个人身上采集的血斑样本组的平均 25(OH)D 结果是否会发生波动。
结果
在第 1 天和第 2 天，在中午采集样本前约 1 小时服用 5000 IU 每日剂量的补充剂（表 1）。对于第 1 天的样本，基于单向方差分析，25(OH)D 全天存在显著波动，p=0.01。对于第 2 天的样本，单向方差分析的结果为 p=0.21。两天中的任何时间点血样 25(OH)D 没有显著差异。对中午采集样本前一小时服用 5000 IU 剂量的两天的汇总结果进行预先计划的单向方差分析，结果显示血样 25(OH)D 全天存在波动，p=0.002。图 1 显示了每个时间点的平均测量值，附加文件 1 显示了平均测量值以及每个时间点的所有五个单独样本的测量值。使用 Bonferroni 校正的事后检验表明，无论是汇总值还是第 1 天的单独值，中午值都明显高于早上和晚上的结果。中午的平均 25(OH)D 浓度比早上样本的平均值高 12% (p= 0.009)（第 1 天为 17%，p= 0.047，第 2 天为 7%，p= 0.41），比晚上样本的平均值高 10% (p= 0.009)（第 1 天为 12%，p= 0.01，第 2 天为 8%，p= 0.49）。
图 1
血点 25-羟基维生素 D 水平每日波动的重复模式。每个点代表从一个人身上采集的五个单独采样的血点 25-羟基维生素 D 测试样本的平均测量值。在第 1 天和第 2 天，中午的样本是在前一天 5000 IU 剂量后 1 小时采集的。在第 3 天和第 4 天，中午的样本是理论谷值，也就是说，样本是在前一天 5000 IU 剂量后约 24 小时采集的。25(OH)D25-羟基维生素 D
在第 3 天和第 4 天，补充剂是在中午采集样本后一小时内服用的。对于第 3 天的样本，单向方差分析显示血点 25(OH)D 在一天内波动（p= 0.02）。同样，对于第 4 天的样本，单向方差分析显示血点 25(OH)D 在一天内波动（p= 0.0003）。由于在第 3 天和第 4 天的三个时间点，平均血点 25(OH)D 存在显著差异（每个 p< 0.01），因此不适合对这些样本进行汇总单向方差分析。但是，第 3 天和第 4 天的昼夜模式分别很明显。第 3 天，中午的 25(OH)D 浓度比早晨浓度高 24% (p= 0.007)，比晚上浓度高 16% (p= 0.21)。第 4 天，中午的 25(OH)D 浓度比早晨浓度高 31% (p= 0.0003)，比晚上浓度高 14% (p= 0.07)。第 4 天中午的 25(OH)D 值是在理论“低谷”即服药前采样时间点测得的，与第 1 天和第 2 天汇总的服药后 1 小时值没有显著差异 (t-testp= 0.742,n= 15,df= 13)。
第 3 天的平均 25(OH)D 浓度比其他 3 天和所有三个采集时间点的平均值低约 25%（ANOVAp< 0.00001，所有成对 Bonferroni 校正比较的 p< 0.013）。第 3 天的 25(OH)D 值较低在 25(OH)D 值散点图中清晰可见（图 1）。第 3 天采样后，我们的参与者报告感冒发作；补充习惯没有改变，但饮食、运动和睡眠都进行了调整以适应疾病。
讨论
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